第二章-3目的基因获得-915.ppt

基因组文库的保存 影印滤膜保存法 1）影印滤膜保存法： 2）保存文库于液体培养基中 从平板上挑取全部克隆，接种于含适当抗生素的液体培养基中，混合的细菌生长数代后，加入终浓度25%的甘油，-70℃保存。 缺点：由于文库菌落生长的不均匀性，可能导致文库中某些特定序列过多或过少。 3）保存单个克隆子于液体培养基中 从平板上挑选单个克隆，接种于含适当抗生素的液体培养基中，菌体生长至一定浓度时，加入终浓度25%的甘油，-70℃保存。 缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。 从基因组文库中筛选目的基因 大型基因组文库由数十万甚至上百万个重组克隆组成，除一些具特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因）可用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选）直接筛选外，一般均需多轮操作步骤。 密集铺板（1-10万） 杂交 挖取 铺板 目的重组克隆 铺板 根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选 通过构建基因组文库获取目的基因的问题： 该方法仅适用于原核基因的分离，较少采用。 不能除去真核生物目的基因的内含子结构。 工作量大，需了解目的基因的背景知识； 不能获得最小长度的目的基因； “鸟枪法(shotgun)”：又称“散弹法” 用限制酶部分酶切染色体DNA 将酶切片段克隆入载体 转化受体细胞并扩增 分离带有目的基因的DNA片段 筛选目的重组子 用“鸟枪法”获取目的基因： 缺点： 操作简便。 工作量大； 具有一定的盲目性。 优点： 优点：保证目的基因的完整性，提高目的重组子 的出现频率，简化操作。 鸟枪法操作的改进： 使用特定限制酶完全酶切染色体DNA。 前提：已知目的基因的酶切图谱。 策略：用目的基因两端的限制酶完全酶切染色体 DNA，然后与载体拼接。 2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb 如： 已知目的基因位于1.8kb的Sal I片段中，将染色体DNA用Sal I切开，琼脂糖凝胶电泳分离，切下1.6-2.0kb区域内的凝胶块，从此凝胶中回收DNA片段，与载体连接。 基因组文库重组克隆的排序 构建大型基因组文库技术上并不困难，若文库插入片段总和为基因组的10倍以上，就能从其中调出任何一段DNA序列。 然而基因文库的克隆是随机序列，必须将所有克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。 这项工作的工作量远大于文库构建。 酶切片段末端标记法 随机探针联合杂交法 染色体走读法 基因组文库重组克隆的排序方法： 酶切片段末端标记法： 1、将单一YAC克隆插入DNA片段用限制酶均匀地水解成若干片段，末端标记同位素。 H H H H 载体DNA 克隆DNA 2、然后用Sau3A将末端标记的DNA片段降解成碎片，PAGE电泳，每10个YAC克隆走在一块板上，形成10个克隆的特征性DNA指纹图谱。 S S S S S S S S S S S S S S S S S S S 10克隆指纹图谱 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3、电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有部分相同，二者就有互相重叠的可能性，在染色体上则可能是排列一起的。 10克隆指纹图谱 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 随机探针联合杂交法： 1、将若干YAC克隆固定在薄膜上，复制20份薄膜；合成20种不同序列的短探针（序列随机）。 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 A B C D E F G 2、用20种探针随机定位杂交（1对1）20份YAC克隆薄膜。若某2个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这2个克隆有可能相互重叠。 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 A B C D E F G 20个随机探针 3、若将杂交阳性结果记为“1”，可清晰地列成一张表，最终排出上述YAC克隆的排列顺序。 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11