第三部分细胞培养与细胞融合.ppt

单克隆抗体制备步骤 获得抗原并注射进小鼠体内，使鼠免疫； 取小鼠的血清与抗原反应，确认免疫反应； 取免疫鼠的脾脏制成悬浮液与鼠骨髓瘤细胞混合融合； 鉴定、筛选产抗体的单克隆融合细胞； 抗体的生产。 单克隆抗体的大量生产 生产方法主要有： 旋转培养管大量培养杂交瘤细胞制备抗体 体内接种杂交瘤细胞制备抗体 ?实体瘤法：背部皮下注射杂交瘤细胞引起肿瘤形成，而后采血分离抗体 ?腹水的制备：小鼠腹腔注射杂交瘤细胞产生腹水再分离抗体 * 五、细胞融合的意义 1）有性杂交变无性杂交,加快育种速度 2）打破远缘杂交的不亲和性 3）创造新细胞质杂种 4）单克隆抗体制备 * 自学内容 动物细胞工程应用 包括生产疫苗、干扰素、单克隆抗体及其它生物制品。 植物细胞工程应用 在食品行业生产香料、调料、天然食品等 固定化细胞应用 固定化方法、有关反应器及其生产应用 * 思考题 1、一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足怎样的条件？ 2、细胞固定化培养及其特点。 3、植物细胞培养中提高代谢产物的技术有哪些？ 4、在离体条件下动物细胞生长方式及培养方法。 5、动物细胞体外生长的要求主要考虑哪些因素？ 6、细胞融合的概念、方法、类型及意义，如何鉴定融合子？ 7、动物细胞工程在生产上有何应用？ * 微载体的种类 以交连葡聚糖为基质的微载体：DEAE-交连葡聚糖微载体、cytodex 2微载体、dormacell微载体、 cytodex 3微载体等。 以塑料为基质的微载体：聚苯乙烯微载体、聚苯烯酰胺微载体。 明胶(gelatin)微载体 以玻璃为基质的微载体 以纤维素为基质的微载体（DE-52、DE-53） 液膜微载体（形成聚赖氨酸微液珠） 大孔微载体（载体内部有大孔互相连通） * （2）中空纤维培养技术 中空纤维培养技术由Knazek于1972年研制成功。空心纤维的材料是聚砜或聚丙烯等高分子物质。纤维壁为半透膜。数百或数千条纤维捆成一束并集中开口，培养液从管腔流过，细胞贴附在纤维外壁生长。 * （3）微囊化技术 微囊化培养由Lim等于1981年提出，其原理是采用一层亲水性的半透膜将细胞包围在珠状的微囊内，因而降低了培养液对细胞的剪切力，培养密度高。 目前采用最多的是多聚赖氨酸/海藻酸法（PLL/ALG法），通过氯化钙成囊，再用柠檬酸液化。 缺点：成囊技术较难，成功率约50%。 * 二、动物细胞体外生长的要求 环境要求 营养要求 温度 pH值 气体 渗透压 葡萄糖 氨基酸 无机盐 维生素 动物血清等 CO2培养箱 * 1）、温度： 不同来源的细胞，其培养的最适温度不同。例如，昆虫及鱼类细胞25-28度，哺乳动物细胞一般为37度； 细胞对低温的耐受力比高温强。 温度除直接影响细胞生长外，还与培养液的pH值有关，温度低时CO2溶解性增加，从而影响pH。 环境要求 * 2）、pH值： 动物细胞培养最适pH值为7.2-7.4，低于6.8或高于7.6均对细胞产生严重影响，甚至导致细胞死亡； 一般原代培养的细胞对pH值要求严格，细胞系对 一定范围的pH值改变有抵抗力。 酚红是常用的指示剂，用来检测pH的变化：红色--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。 * 3）、气体： 细胞在培养初期对溶氧要求较少，但在快速增殖（对数增长期或指数增长期）要求有较多的溶氧。 4）、渗透压： 培养液的渗透压一般保持在与体液相同的水平，对细胞较为适宜。例如，生理盐水或平衡盐溶液。 * 动物细胞培养营养要求高，培养液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。 分天然培养基、合成培养基和无血清培养基。 营养要求 * 1）、天然培养基： 来自动物的体液或组织液，早期广泛采用。例如：血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）等； 优点：营养成分丰富，培养效果好，符合细胞生长的要求； 缺点：成分不确定，来源复杂、有限，不能做到标准化，易发生支原体污染。 * ?血清中含有： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）； ②多种金属离子； ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等； ⑤各种生长因子； ⑥转移蛋白； ⑦其它不明成分。 * 血清种类及来源： (1)胎牛血清 (2)犊牛血清：犊牛出生后，不给吮乳，尽早由颈动脉无菌放血。 (3)牛、马、羊血清：通常由颈静脉采取，或屠宰时由颈动脉放血采取。 (4)其它血清：如兔血清和鸡血清等， * 2）、合成培养基： 根据动物的体液成份和细胞生长