第九讲蛋白质相互作用2011.ppt

* 广泛的用于蛋白相互作用的鉴定和蛋白表达文库的筛选 首先，表达带有标记的bait蛋白，标记可以是同位素标记，也可以使与bait蛋白用和表达的可用于后期检测的tag，如flag，gst等 然后，制备表达文库样品，细胞裂解液或者体外表达的蛋白文库，电泳 第三步，结合反应 第四步，显色反应，tag标记的用抗体显色，同位素标记的放射自显影显色 HRP: 辣根过氧化物酶 衍生方法，如westernblot等 * 将各种蛋白质有序地固定于固相支持物上，成为检测用的芯片。用标记了特定荧光抗体的蛋白质或其他成分与芯片作用, 用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术,测定芯片上各点的荧光强度,通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的有无和强弱, 达到测定各种蛋白质功能的目的。 优点：高通量、自动化 缺点：维持蛋白的天然结果和生物学活性；假阳性高、重复性差，蛋白芯片成本高， * FRET是一个非辐射的、偶极间耦合的过程 其基本原理是两个荧光发色基团在足够靠近时, 当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态, 在该电子回到基态前, 通过偶极子相互作用, 实现了能量向邻近的受体分子转移。 优点：完整细胞中，正常的生理状态下，亚细胞定位（免疫沉淀和亲和层析），直接的、特异性的相互作用（免疫细胞化学），定时定量， 局限性：蛋白需要标记，能量的转移需要两个发光基团足够靠近，因此两个检测蛋白发生相互作用但与之相连的发光基团距离较远，也不能检测到阳性结果 * 表面离子共振技术(SPR) 与质谱技术的连用 探针或配体固定在传感器芯片上，含有分析物的液体流过传感器表面，如果发生了相互作用可引起折射率的改变，从而可实时、定量检测分子相互作用，结合在传感器表面的蛋白用MS进行鉴定 这种方法实现了定性和定量的结合，不用标记，可得到相互作用的亲和力和相互作用蛋白的序列信息。 体外实验体系，仪器昂贵 ITC：是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，现在已开始广泛地用于蛋白质相互作用的研究。 基本原理：蛋白与蛋白结合，要么产生热量，要么吸收热量，通过一个高灵敏度、高自动化的微量热量测定仪，可以连续、准确地监测和两个蛋白接触到后的热量变化情况，从而计算出是否有相互作用以及亲和力的大小。 优点：蛋白样品不用标记和修饰，反应体系小，灵敏度和精确度高，能够获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵等等，应用范围广，可用于研究蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子（如：DNA、RNA，化合物等）相互作用；生物大分子-细胞相互作用 缺点：体外反应，需要表达纯化得到高纯度和高浓度的蛋白，反应是非特异性的 * * * * * * 认识最早的结构域 尤其在受体酪氨酸信号通路中发挥不可或缺的作用 SH2结构域相互作用改变所导致的信号转导通路异常与多种肿瘤及遗传性疾病的发生和发展存在密切的关系。 * 酪氨酸激酶是一种功能重要且存在广泛的酶，是细胞信号转导通路中的一类最重要的蛋白分子。正常情况下酪氨酸激酶的活性是受特定的分子内或分子外调控机制调节的，如果这种调控机制被破坏则会造成激酶活性的失控，可能最终导致肿瘤的发生。 * 在癌蛋白v-Src中，Y527被苯丙氨酸取代，或包括Y527在内的C-末端18个氨基酸被不能抑制激酶活性的12个氨基酸所取代， 都能够使Src失去抑制性的调节中心，因此表现出组成性的激酶活性，导致肿瘤的发生。 * * PAP: potato acid phosphatase mock PAP: potato acid phosphatase that had been previously incubated with the phosphatase inhibitor sodium orthovanadate 527ptyr：527tyr phosphorylated tail peptide 527: unphosphorylated tail peptide ptyr: free phosphotyrosine * SHP-2，酪氨酸磷酸酶，一种重要的信号转导分子 * Missense Mutation of b Subunit of the Epithelial Sodium Channel Gene * * Parkin突变引发PD，研究parkin的底物蛋白以及相互作用蛋白，有助于PD发病机制的揭示 Parkin的突变有点突变、移码突变、缺失突变，其中我们注意到，有一类缺失突变是缺失C末端的12个氨基酸残基，其他功能性的结构域都正常 而缺失的C末端属于典型的PDZ结构与结合模体 根据这一现象，推测parkin与PDZ蛋白的结合在PD的发病机制中可能有重要的作用。