第二章基因工程的基本技术.ppt

第二章 基因工程的基本技术 第一节 核酸的提取与纯化 一、一般程序 2、供体核酸的分离 凝胶电泳：有无杂带，降解 光密度值测定：OD值 DNA A260/A280=1.8~2.0 RNA A260/A280=2.0 ~2.1 限制性酶切分析：酶切结果（有无影响酶活性的蛋白质存在） 二、DNA的分离与纯化 1 .碱抽提法提取质粒DNA （2） 所用的试剂作用 ⑤ KAc-HAc缓冲液 （3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤 第二步：破膜，蛋白质和DNA变性 第八步：沉淀DNA 2. 影响质粒DNA产量的因素 （2）质粒拷贝数 （二）供体DNA的分离与纯化 2. 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提 3. 从植物组织中制备 DNA 三、DNA的定量和纯度测定 测量样品的吸光度用A表示 标准样品在260nm下 1μg /ml DNA =0.02A 即 A260=1时 双链DNA含量为 50 μg /ml 单链DNA含量为 40 μg /ml 寡苷酸含量为 30 μg /ml 经验数据： 纯净DNA A260/A280=1.8 纯净RNA A260/A280=2.0 四、DNA分子量的估计 五、RNA的分离与纯化 1、制备RNA的关键：防止内源、外源RNase的作用 1) RNase的特点：抗酸碱，具有很广泛的PH作用范围，抗高温严寒（0～65℃ 均具活性），抗变性剂 2）解决办法 外源RNase——高温，焦磷酸二乙酯（DEPC）处理 所有溶液和器皿，带手套 内源RNase——高温抽提，强蛋白变性剂，RNase抑 制剂，蛋白酶K 3、RNA的质量评估方法 第二节 DNA的凝胶电泳 二 、琼脂糖凝胶电泳 3.琼脂糖凝胶的分辨力 三 、聚丙烯酰胺凝胶电泳 四、凝胶染色 UVP全自动凝胶成像分析系统 第三节 分子杂交技术 核酸分子杂交 一、Southern blot Southern blot 筛选结果 二、Northern blot 三、 菌落原位杂交 （3）Taq DNA 聚合酶 （1）DNA变性 （2）DNA复性 （3）DNA链的延伸 （5）新一轮循环开始 2. PCR的过程 3. PCR的特点 （4）简便 三、 影响 PCR的因素 ④ Taq DNA聚合酶的激活剂 2、其它耐热的 DNA聚合酶 3、引物（primer) ②引物的长度 ③引物的碱基序列 ④引物的Tm值 ⑦ 套嵌引物（nested primers) 4、模板（template) 5、dNTPs 6、Mg 2+ 的浓度 四. PCR技术的应用 2、反向PCR 3、不对称PCR 4、反转录PCR（RT-PCR) 5、基因的体外诱变 6、基因组的比较研究 1. 原理 2. 技术要点 3. Sanger双脱氧终止法测序过程 二、DNA自动化测序 三、Maxam-Gilbert化学修饰法 2. 碱基特异的化学修饰法 3. 测序过程 测序读片 四、DNA杂交测序 2. 技术要点 （1）非放射性标记 1981年第一台商业化DNA自动测序仪诞生 荧光物质标记，激光激发下发出不同颜色的荧光。 1. 技术要点 （2）不同的标记对象 既可标记引物，也可标记ddNTP。 Sanger脱氧终止法。 原理 利用激光探头直接读胶，实时阅读。 同时，电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出DNA序列。 （4）若对ddNTP进行标记，反应可在一个试管中进行 （3）反应、读片、分析的自动化 测序仪 ①分别用4种荧光物标记引物，区分反应产物，可在同一管中进行 ②可在单一泳道混合电泳 ③激光一次读胶 ④电脑合成结果 2. 荧光标记引物的自动化测序 1977年，哈佛大学的A.M. Maxam和W. Gilbert发明。 Walter Gilbert, 1980年Nobel Prize化学奖 化学试剂 阅读碱 基顺序 1. 原理 末端放射性标记的DNA单链 特定的碱基中引入化学基团 DNA在被修饰的核苷酸位置断裂 只差一个核苷酸的DNA混合物 凝胶电泳