慢病毒包装试剂盒说明书.doc

YRGene慢病毒包装试剂盒说明书 产品编号：LPK010 产品规格：10个10cm皿 产品简介： 赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分： （1）优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。 （2）高效转染试剂（Invitrogen Lip2000原装产品分装，293T细胞转染效率接近100%）。 （3）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。 产品组成： 产品名称 规格 每平皿用量 使用次数 贮藏条件 YRGene Lentiviral Mix （包装质粒混合物） 120ul 15ul 10~12次 -20℃ ul 30ul 10次 4℃ ml 3ml 10~11次 4℃ Tube A Tube B Opti-MEM I Medium 1.5 ml Opti-MEM I Medium 1.5 ml YRGene Lentiviral Mix 20ul Lip2000 30ul 慢病毒表达载体 （客户自行准备，大提质粒） 10ug 配好后，放置5min，然后将A管缓慢加入B管，混合均匀。 室温放置20min，使得脂质体-DNA混合物形成。 Tips：混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。 然后将混合液逐滴均匀加入10cm培养皿，轻微混匀。置于37℃，5% CO2培养箱中培养过夜。 第三天，更换培养基，加入10ml的完全培养基，同样注意不要加抗生素。 转染后48-72h后收取上清，转移至15ml离心管。 Tips：上清里面含有病毒，请小心操作。 3000rpm在4℃离心15min，去除沉淀。 上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。 慢病毒浓缩： 每10ml过滤后的病毒初始液，加入Concen Solution 3ml，每20-30min混合一次，共进行3-5次。 4℃放置过夜。 4℃，3000 g，离心45min。 去掉上清，静置管子1-2min，吸走残余液体。 加入无血清DEME充分溶解慢病毒沉淀。 病毒悬液分装成200μl每份,保存在离心管中，速冻后储存在-80 ℃。 慢病毒滴度测定： 进行慢病毒感染实验之前，我们强烈建议您进行慢病毒滴度检测。 在滴定测定的前一天取48孔板，每孔接种3×104 293FT细胞。 加polybrene到新鲜的完全培养基中，使其终浓度为8μg/ml。 加含有polybrene的完全培养基10倍稀释病毒。具体操作如下：取一个1.5ml离心管（或96孔板），加入90μl培养基和10μl待测病毒原液，混合均与后吸取10μl病毒混合液至第二个离心管（或96孔板第二个孔），混合时尽量不要产生气泡，如此稀释至第八个孔（即稀释105倍）。 Titer 1μl 0.1μl 0.01μl 0.001μl 0.0001μl Virus Stock 10 10 10 10 10 Medium with 8μg/ml polybrene 90 90 90 90 90 Load volume 10 10 10 10 10 各取10μl病毒稀释液到对应的48孔中，置于37℃，5% CO2培养箱中培养过夜，16h-24h后用新鲜的完全培养基换液。 转染后72h，用荧光显微镜技术荧光细胞数量（如果观察不清晰可以先用PBS换液后再进行观察）。一般情况下，在最高稀释度10m的孔数出现N（N10）个带荧光的细胞，则病毒滴度为N×10m TU/ml（10m为稀释倍数），若N10，则需要继续稀释。 注意事项： 细胞的生长状态对于病毒包装至关重要，因此需保证良好的细胞生长状态和较少的细胞传代次数。 病毒切勿反复冻融，如果实在需要冻融，次数尽量不要超过3次，每冻融一次大约有10%左右的病毒损失，应按照每次使用的病毒量来分装，保存于-80℃。保存时间尽量不要超过6个月。 Y