游离DNA提取原理和方法.ppt

血中游离DNA简称循环核酸指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。 游离DNA大部分都是双链DNA分子，血中游离DNA片段远小于基因组DNA，片段长度集中在0.18～21kb之间。 疾病的早期诊断，预后，检测。 提取DNA总的原则 : 1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。 结构： 特殊硅基质吸附材料，特异性吸附DNA，而RNA与蛋白质穿过。 特点： 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 即非核酸大分子污染物主要包括蛋白质，多糖和脂类物质等；非需要的核酸分子，是指制备DNA时，RNA为污染物，制备RNA时，DNA为污染物，制备某一特定核酸分子时，其它的核酸分子均为污染物；至于在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子，由于对后继实验有影响，往往需要很好地去除。 从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白 它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。能与变性的蛋白相结合 DNase作用时需要一定的金属离子作辅基 edta螯合剂能螯合细胞表面膜蛋白的二价金属离子，主要是钙离子。失去钙离子的膜蛋白会失活，导致细胞膜结构破坏。 低温时有利于质粒沉淀，但相应盐也会大量沉淀. 4C 离心操作有利于更彻底去除蛋白质。 低温下DNA溶解度小。 所以要用70%乙醇洗涤DNA沉淀(因为在70%乙醇里DNA是不溶的,而盐离子却可溶),用无水乙醇则达不到这个目的!OK? 4C 离心操作有利于更彻底去除蛋白质。如果核酸抽提的起始样品是杂质比较多时 TE为Tris-HCl和EDTA的混合液，EDTA可以螯合金属离子和DNase，Tris-HCl可以维持一定的pH，以稳定DNA结构. 游离DNA的提取 ----天根试剂盒过柱法 SYW 2016.05.25 游离DNA介绍 提取原理 提取流程 各缓冲液介绍 游离DNA介绍 方法 优点 缺点 酚-氯仿 成本低 效率低，重复性差，有毒 磁珠法 小片段也可以，自动化 纯度低、盐分残留，不适用微量 硅胶柱法 简便快速，纯度高 不适合小片段 　方法比较 破坏红细胞,通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异,先使红细胞裂解,经离心后收集白细胞 白细胞裂使膜蛋白和核蛋白变性,游离DNA,通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性 除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质,使DNA留在上清液中 在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出　　　　　 　原理 本试剂盒采用离心吸附柱和缓冲液系统。样品裂解后，DNA在高盐条件下与硅胶膜结合，在低盐，高PH值时从硅胶膜上洗脱下来 。 外周血 细胞裂解 上层溶液 血清 抽提 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 　提取流程 产品名称 作用 GA 裂解细胞，为蛋白酶K提供适合的反应体系 GB 蛋白变性剂，暴露DNA GD 去除残留的蛋白质 PW 洗脱脂类、蛋白及盐类等杂质 TB 溶解储存DNA 　各缓冲液介绍 2.SDS ：十二烷基硫酸钠 3.Tris-HCl和NaCl：缓冲液 4.EDTA 作用：细胞裂解时,调节溶液的PH,维持一定的离子浓度 作用：a. 溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性，与蛋白质结合成为复合物而沉淀下来 作用：是二价金属螯合剂，使影响DNA的DNA酶中的钙离子和镁离子和EDTA结合,使酶失去活性,有利于提取完整DNA。 1.Proteinase K: 作用：能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将DNA游离 　主要试剂介绍 5.酒精 作用：任意比和水相混溶，夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合 DNA 以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。不存在金属离子的干扰，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定 DNA的保存 ： 吸附柱 ： 即非核酸大分子污染物主要包括蛋白质，多糖和脂类物质等；非需要的核酸分子，是指制备DNA时，RNA为污染物，制备RNA时，DNA为污染物，制备某一特定核酸分子时，其它的核酸分子均为污染物；至于在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子，由于对后继实验有影响，往往需要很