2014年山西大学酶标仪使用方法.ppt

主要内容 一、ELISA法介绍 二、酶标仪和多功能酶标仪 三、仪器操作 一、ELISA法介绍 经典的化学分析方法（如滴定分析、重量分析、分光光度法）能对化学体系组分进行常量或微量分析，而对复杂生物体系的微量成分的测定往往力不从心。 在此背景下，科学家研发了一系列测定生物体系成分含量的方法，其中免疫化学法（如酶联免疫法、免疫荧光法、放射免疫法）因具有高特异性、超微量分析生物体有机成分的特点而得到迅速推广和发展。 1971年人们建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，并进行定量，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法，简称ELISA。 （Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay） 酶联免疫法的专用仪器就是酶标仪。 分析原理 酶标仪的分析原理与分光光度法一样，服从朗伯比尔定律。物质的含量与显色液的颜色深浅成正比，而颜色深浅可用吸光度表示，所以物质的含量与吸光度值成正比。 酶标记抗原或者抗体发生免疫学反应后，与底物的结合物，在特定波长下有最大吸收，可通过测定显色液的吸光度对待测物进行定量。 ELISA法知识 1.免疫学知识 2.常用的ELISA分析 3.ELISA 应用 1.免疫学知识 什么是抗体？ 什么是抗原？ 什么是抗原抗体反应？ 什么是抗体(Antibody)？ 抗体是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)。 人类免疫球蛋白有五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 含有免疫球蛋白的血清称免疫血清。 免疫球蛋白（Ig） 免疫球蛋白（Ig）是机体受抗原刺激后产生的，其主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原-抗体复合物。可以阻断病原体对机体的危害，也可以引起过敏反应或其他有害反应。 抗原的特异性 各种抗原物质的化学组成虽然很复杂，但能刺激机体产生抗体并与抗体反应相结合的化学组成，仅仅是抗原物质表面的一些具有活性的化学基团、化学结构及空间构型，被称为抗原物质决定簇。 分子结构的差异性，决定各种物质抗原的特异性。 抗原抗体反应 抗原与抗体的反应统称为免疫学反应。在体内进行的抗原抗体反应称为免疫反应，在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应。 没有抗原的刺激，机体不能产生抗体；利用抗体可以检测抗原物质。 ELISA法特点 ELISA法是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。 由于测定中需要酶标记抗原或抗体，酶分子与抗原或抗体分子的结合物可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。 2.常用的ELISA分析 1).测定抗原 2).测定抗体 (1)测定抗原 A??将抗体吸附于固相表面，这个过程叫包被。 B 加抗原，形成抗原-抗体复合物。 C? 加酶标抗体。 D 加酶反应的底物。反应终止时，反应液的颜色深浅与抗原的含量成正比。 主要步骤 1.包被抗体的酶标板（一抗）。 2.加待测抗原。抗原抗体反应，洗涤。 3.加酶标抗体（二抗）。反应，洗涤。 4.加显色底物（三抗），反应，洗涤。 5.加终止液。 6.酶标仪上读取吸光度值。 7.根据标准曲线对待测抗原进行定量。 (2)测定抗体 A 抗原包被在酶标板。 B 加抗体，形成抗原抗体复合物。 C 加酶标抗体（一抗） D 加酶底物（二抗），显色，比色。 3.ELISA方法的应用 原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。 在实际应用中它和医学、生物化学、免疫学、微生物学、药理学、环境学等方面密切相关。 举例 医学方面：肿瘤研究中检测甲胎蛋白；检测过敏原；检测血清中白蛋白及免疫球蛋白；传染病诊断中检查乙型肝炎表面抗原。 环境科学方面：测定污染物抗原干预下生长因子、细胞因子、酶的变化。 其他：植物组织浆液中检查植物病毒；普通比色分析。 比色装置： 聚苯乙烯塑料微孔板：96孔 光电检测器 酶标仪与光度计的区别 波长：4-6个 比色装置：酶标板，非比色杯 光路：垂直 功能：不能波长扫描；只在固定波长的可见光范围测定；可对化学物及生命组分进行终点分析。 酶标仪的应用 普通酶标仪基本功能有2个： （1）相当于分光光度计：测定化合物含量或者细胞存活率等。 （2）基于免疫反应的ELISA分析。 新型的多功能酶标仪价格在20-50万元，分析功能得到广泛拓展，这对酶标仪的应用有深刻的意义。 ELISA的局限性 世界卫生组织专家组提出对ELISA的评价认为：“ELISA作为免疫诊断应用是一个好办法，但要做好它不容易。” 1.对ELISA法的非特异性评价的资料