DNA重组生物实验报告课件.doc

DNA重组生物实验报告 课程名称：_生命科学导论实验课_ 指导老师：______成绩：__________________ 实验名称：__基因工程实验__ 实验类型：__生物实验_______同组学生姓名：__ 实验目的和要求 基因工程实验是生物实验中极具代表性的一部分，在此次实验中有如下目的和要求： 通过本实验了解和掌握含GFP基因质粒的提取和琼脂糖DNA电泳的等十个小实验组合而成的基因工程实验的原理和技术。 了解生物实验的完整流程，对实验室基本操作规范与仪器设备使用方法得到初步了解，从而建立系统、有条理的实验思路。 培养实验动手能力，在实践中加强对专业知识的认知与体会，融汇贯通，寓学于用，感受生物学科的魅力。 实验内容和原理 基因工程又称DNA重组技术，是将不同来源的基因按照预先设计的蓝图，在体外构建成杂种DNA分子（又称重组DNA分子），然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种和生产新产品等。基因工程技术为生命科学的研究提供了有力的手段，同时为以基因工程技术为核心的现代生物技术产业的建立奠定了扎实的基础。 基因工程技术建立的标志性实验是：①1972年，美国斯坦福大学的伯格(P.Berg)等人将猿猴病毒SV40的DNA和大肠杆菌λ噬菌体DNA分别进行EcoRI酶切，然后用T4DNA连接酶将两个酶切片段进行连接，率先完成了人类历史上第一个DNA分子的体外重组实验，因此荣获了1980年的诺贝尔化学奖。②1973年，美国斯坦福大学的科恩（S.Cohen）等人在体外构建了含四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒，并将其导入大肠杆菌中，获得了双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。上述两大科研成果标志着基因工程技术的诞生。 一个典型的基因工程技术包含以下几个步骤： 目的基因和载体DNA的获取。 目的基因和载体DNA的限制性内切酶的酶切消化。 酶切后的目的基因和载体DNA的体外重组连接，以获得重组DNA分子。 通过细菌转化等技术，将重组DNA分子导入细菌等活细胞。 转化细胞的筛选鉴定以及目的基因表达的检测。 其中目的基因、载体、工具酶及宿主细胞是缺一不可的，因此被称为基因工程的四大要素。 实验一 含GFP基因质粒的提取 目前获取目的基因DNA片段常用方法是：从Gene Bank中查得目的基因的DNA序列，根据序列设计引物，通过PCR的方法扩增目的基因的DNA片段。 根据目的基因的来源不同，用于PCR扩增的模板DNA，大致有两个来源：①由于真核细胞DNA的基因编排方式，是由内含子和外显子等组成，因此，只能通过提取目的基因的mRNA，逆转录合成出cDNA，作为PCR的模板。②原核生物的DNA其基因是连续的。因此提取原核细菌的DNA，就可用于PCR的扩增。本次实验的目的基因就是来自一种细菌编码的脂肪酶基因。 细菌基因组DNA的提取先是用溶菌酶及蛋白酶K裂解细胞，释放DNA、RNA及蛋白质等。然后用苯酚/氯仿处理，使蛋白质变性，经离心去除蛋白质及细菌碎片，DNA和RNA存在于上清水相中，然后用RNase分解RNA，酒精沉淀DNA，即可获取目标基因组DNA。 实验二 琼脂糖DNA的电泳 DNA分子是两性电解质，在溶液中形成兼性离子而携带电荷，带电分子在电场中将产生移动，这种现象称为电泳。带电分子在电场中移动的快慢，除受到场强、缓冲液类型及缓冲液离子强度等外界因素的影响外，还受到分子的大小、带电量及分子的形态等自身因素的影响。为避免断电后电泳分开不同DNA分子的迅速扩散混合，DNA电泳常采用琼脂糖的凝胶电泳。 实验三 PCR扩增目的基因 1985年美国Cetus公司的穆利斯等人设计并研究成功了一种体外核酸扩增技术PCR（Polymerase Chain Reaction），从而荣获了1993年诺贝尔化学奖。这种聚合酶链式反应是一种类似于细胞内DNA的天然复制过程，利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异的DNA片段。将目的基因DNA在高温（94℃）下解链成为单链模板；人工合成的一对与目的基因两侧序列相互补的寡核苷酸引物在低温（40～60℃）下分别与变性的目的基因片段两侧的两条链的部分序列互补结合；在中等温度（65～75℃）下由耐热DNA聚合酶（Taq酶）将dNTP中的脱氧单核甘酸加到引物3’-OH末端，并以此为起点，沿着模板以5’→3’方向延伸，合成一条新的互补链。新合成的DNA链的起点是由加入的引物在模板DNA链两端的退火位点决定的。 由于PCR反应中，双链DNA高温变性成单链，引物与模板单链DNA低温退火（配对），适温下引物延伸3个步骤反复循环，每一循环所形成的DNA分子均能成为下一循环的模板，所以PCR的特定目的DNA产物以指数方式递增，在数小时内，经过30个循环后，理论上可使D