ELISA的原理课件.ppt

* 前面所讲述的凝集反应、沉淀反应以及今天要进行的补体结合反应均属于经典抗原抗体反应的范畴，这些反应的原理非常简单，就是抗原抗体的特异性结合，反应结果可以通过肉眼来直接观察凝集团块、沉淀线或者溶血现象。然而，这些经典方法的缺点是对于所检测抗原抗体的浓度要求比较高，敏感性较低，当抗原抗体量较低时，很难出现肉眼可见的上述现象。此外，用肉眼观察结果具有一定的主观性，不同的观测者可能判定的结果不一致，比如试管凝集反应凝集程度的判定。 因此，需要一种辅助性手段来提高抗原抗体反应的敏感度和标准化，免疫标记技术的发明解决了这一问题。 * 酶反应的最大特点是：高效性，一个酶分子可以结合多个底物分子，发挥酶解作用。因此，将酶连接在实验所需的抗体中，可以对抗原抗体反应有一种放大的效应，具有高灵敏度的特点 免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，免疫组化即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 * 酶联免疫吸附试验属于免疫酶技术的一种 根据标记对象和检测对象的不同，可以分为多种类型，以其中一种来介绍这种方法的基本原理i： 首先以已知抗原包被酶标板，吸附一定时间后，洗涤未结合的可溶性抗原成分。 在吸附有抗原的酶标板中，加入待测血清，孵育一定时间，使待测血清中的特异性抗体与包被抗原充分反应、结合，之后充分洗涤未与抗原结合的游离抗体成分。 在吸附有抗原抗体复合物的酶标板中，加入针对待测抗体来源种属的酶标二抗（即若待测血清来自人，那么应加入抗人的二抗。免疫球蛋白的免疫原性可以分为同种型、同种异型和独特型，其中同种型抗原决定簇存在于CH和CL区，因此，以某一种属的IgG免疫另一种属，可以获得针对该种属所有IgG的特异性结合的抗体，由于是针对抗体的抗体，将其称之为二抗。在这个试验当中，正是利用二抗的这一特点，用于最后的酶反应显色，因为这样就可以同一种属的同一类抗体制备一个酶标二抗，这一二抗可以用于来自该种属所有同类抗体的检测。 酶标二抗吸附一定时间后，充分洗涤，去除未结合成分。 加入标记酶的相应底物，孵育一定时间后显色。 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA ） ELISA的基本原理 ①使抗原或抗体结合固相载体表面，并保持活性。 ②使抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原。 ③在测定时，把受检抗体（或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体）起反应。 ④用洗涤的方法去除未结合的酶标抗原（或抗体），最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ⑤加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。 ⑥产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来定性或定量分析。 免疫标记 定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC异硫氰酸荧光素，PE藻红蛋白 免疫酶测定法：HRP辣根过氧化物酶，AP碱性磷酸酶 免疫酶测定法(Enzyme Immuno Assay,EIA) 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) 特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。 1.定义 2.分类 间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Li