GMO检测的作业指导.doc

2004年11月 转基因食品检查方法说明书 作成日：2004年11月10日 青岛食品研究所 作成者：杜芳 第一次修改 原理 本方法主要分为三部分，首先提取DNA；然后将提取出的DNA进行PCR扩增；最后琼脂糖凝胶电泳分析DNA并用凝胶成像系统检测扩增结果。 制备样品 选择需要粉碎的样品，将样品用组织捣碎机全部粉碎。组织捣碎机每次粉碎约500ｇ的样品，最大速度粉碎1.30min。将粉碎好的样品装入样品袋中，在样品袋上写样品编号编号。将袋充满空气，手握袋口，混匀10次。 将样品袋放平，分成八个区，每个区用50ml的离心管取满一管，放到另一个写有编号的小样品袋中，混匀。 4、 每个样品准备2个50ml的离心管，写样品详细编号。如：03-09-1A，03-09-1B。写简单编号：1，2，3等等，称取适量已粉碎好的样品到每个管中。 注：根据附录1表格称取不同的量，并根据需要选择15ml或50ml离心管。 用mini工具提取DNA的方法 注：提前约1小时将AP1缓冲液放在烤箱中恒温65℃。用3%H2O2擦桌子，铺膜。所有的操作全在膜上进行。 1、 将装样品的离心管盖子全部取下，对应位置放好。每个样品管中加入适量的RNase A和AP1缓冲液，混匀。 注：根据附表1加不同量的AP1缓冲液。若混匀后样品没有完全浸泡，再适当加入AP1缓冲液。加工品加入20uL的RNase A，未加工品加入15 uL的RNase A。 2、 样品管和灭菌超纯水（D.W）同时保温65℃，30min。在这期间准备紫柱、1.5ml白管、白柱和空柱管。在每个管上写简单的编号（一个编号一个）。 第一排空柱管、第二排白柱、第四排1.5ml离心管、第五排紫柱。 3、 在每个1.5ml离心管中加入675ulAP3/E缓冲液。 4、 取出保温完毕后的样品管，加入1/3AP1体积的AP2缓冲液，混匀。离心20min，4200rpm。 5、 从离心后的样品管中慢慢取650ul的上清液到紫柱中。将紫柱离心14000 rpm，3min。 取紫柱上清液450ul加到已加了675ulAP3/E缓冲液的1.5ml离心管中，混匀。再从1.5ml离心管中取600ul的混合液加到白柱中，离心到14000 rpm。离心后倒掉柱下废液。 将1.5ml离心管中剩下的混合液全部吸到白柱中，离心到14000 rpm，倒掉废液。 将白柱取出放到新的白柱管上，加入500ulAW缓冲液，离心到14000 rpm。倒掉废液。再加入500ulAW缓冲液，离心14000 rpm，3 min。离心期间准备新的1.5ml离心管。盖上写样品的详细编号。 将白柱取出放在新的1.5ml离心管上。取100ul保温的 D.W.加到柱上溶解DNA。 注：移液枪的枪头轻触膜加超纯水，换枪头，加一个盖一个。 室温放置10min，离心14000rpm，3min。离心后扔掉1.5ml离心管上的柱子，混匀。 用分光光度计测DNA浓度。 分光光度计的使用方法见附录2。 调浓度。 定性PCR测定时所需的DNA浓度为20ng/ml，若原液浓度小于20ng/ml，PCR时直接用原液。 注： 在新1.5ml离心管写上需要调制的最终浓度和详细编号。一般取样液20ul（取的体积不能少于10ul）。在管中加稀释所用的超纯水，加入样液，混匀。取小样品袋写编号。如：3/25提取，装有DNA的原液管，-20℃保存。 用G-tip工具提取DNA的方法 注：加工品DNA的提取方法中所用的缓冲液配制方法见附录3 提前约1小时将G2缓冲液放在烤箱中恒温50℃。用3%H2O2擦桌子，铺膜。所有的操作全在膜上进行。 1、 将装样品的离心管的盖子全部取下，对应位置放好。 每个样品管中加入20ul的RNase A，200ul的蛋白酶k和适量的保温G2缓冲液，混匀。50℃保温2小时。 注：根据附表1加不同量的G2缓冲液。 2、 保温期间准备三套15ml的离心管。中间一排放上柱子，每个管上写简单编号。每个柱子中加入1ml的QBT缓冲液平衡柱子，盖子盖在柱子上。 3、 将保温后的样品管离心4200rpm，20min。离心后取2ml上清液加到柱上，过滤。 剩下的上清液吸到另一套15ml管中。再取2ml上清液加到柱上，过滤，倒掉滤下的废液。 用QC缓冲液洗柱子3次，每次2ml。 将柱子放到第三套15ml离心管上。用保温的QF缓冲液溶解DNA 2次，每次1ml。期间准备2ml离心管，盖上写详细编号，每个号码2个。 在每个2ml离心管中加入700ul异丙醇和1ml的样液。离心140