产气荚膜梭菌毒素基因分型PCR检测方法的建立及初步应用.pdf

动 物 医 学 进 展 ，2017,38(3): 59-63 Progress in Veterinary Medicine 产气荚膜梭菌毒素基因分型P C R 检测方法的建立及初步应用 赵 凤 菊 ，关 淼 ，李井春，杨 本 勇 ，赵晓彤 (辽宁省动物疫病预防控制中心，辽 宁 沈 阳 110164) 摘 要 ：建立一种快速鉴别诊断不同型产气荚膜梭菌的P C R 检测方法，为动物产气荚膜梭菌病的快速 诊断及流行病学调查提供有效的技术手段。克服传统鉴定方法耗时长 、费用高的缺点，提高了检测效率。通 过对产气荚膜梭菌a 毒素、P 毒素、e 毒素和 t 毒素基因序列分析，利用 P r e m i e r 5 . 0 软件设计并合成了 5 对特 异性引物，建立了针对 5 种不同型产气荚膜梭菌的P C R 鉴别诊断方法。通过反复试验确定了最佳退火温度 为 5 3 C 。通过灵敏度试验表明，P C R 检测方法最低能检测到的D N A 浓度 a 毒素为 308 pg/juL， [] 毒素、e 毒 素为 30. 8 pg/juL， t 毒素 A 为 0. 122 pg/juL， t 毒素 B 为 0 . 0 5 pg/juL 。通过特异性试验表明，本方法具有较 高的特异性。同时，通过对本方法检测出的阳性样品16 S r R N A 序列分析发现，与 G e n B a n k 中的其他产气 荚膜梭菌的16 S r R N A 序列同源性均在9 8 % 以上。表明建立的检测方法灵敏度高、特异性强，可以应用于 动物产气荚膜梭菌病的实验室诊断。 关键词：产气荚膜梭菌；毒素基因；聚合酶链反应；鉴别诊断 中图分类号：SS859. 87 文献标识码：A 文章编号：1007-5038(2017)03-0059-05 产气英膜梭菌（C/cwZriiiiMTO per/riwgews )是一■种 1 材料与方法 能够形成芽胞的革兰阳性厌氧菌，是人类、家畜和野 1. 1 材料 生动物共患的一种病原菌[1]。本菌在环境中广泛分 1.1.1样品羊梭菌病多联干粉灭活疫苗，哈药 布，主要通过毒素导致机体发病。不仅可以导致各种 集团生物疫苗有限公司产品^毒素阳性质粒；n 号 动物坏死性肠炎、肠毒血症，还可以引起人类食物中 炭疽芽胞苗，新疆天康畜牧生物技术股份有限公司 毒、坏死性小肠结肠炎和气性坏疽[2]。这些疾病大多 产品；大肠埃希菌ATCC25922，杭州市天和微生物 数发病迅速，治疗困难，常常致命。因此，必须依靠预 试剂有限公司产品；金黄色葡萄球菌、沙门菌、奇异 防措施控制，包括疫苗接种[3]。产气荚膜梭菌细菌分 变形杆菌、猪链球菌、巴氏杆菌，由辽宁省动物疫病 离培养、生化鉴定及家兔肠袢肠毒素检测试验等传统 预防控制中心保存。 诊断方法不仅耗时长，同时因需要用家兔作为实验动 136份临床样品为病死动物的肠内容物及患病 物进行肠毒素检测而增加检测成本。因此，有必要建 动物的新鲜粪便。 立一种快速、敏感、特异的分型诊断方法。目前，产气 1. 1. 2 主要试剂 DNAzol® Reagent提取试剂，In- 荚膜梭菌毒素至少已发现19种，其中 a 、|3、e 和 t为主 vitrogen 公司产品；Ex Tiig DNA 聚合酶、10 X Ex-Iiig 要致死毒素，根