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RT-PCR技术原理、步骤与注意事项
RT-PCR 技术原理、步骤与注意事项
RT-PCR 简介
RT-PCR 的指数扩增是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的RNA 。
RT-PCR 广泛应用于遗传病的诊断,并且可以用于定量监测某种 RNA 的含量。(检
测基因表达的方法,参见 Northern Blot 法。)
RT-PCR 有时候也会指代实时 PCR(real-time PCR) 。为了与逆转录PCR 相区别,
通常被写作“定量 PCR”(quantitative PCR)或者 RTQ-PCR(real-time quantitative
PCR) 。
实时 PCR
实时 PCR(real-time PCR) ,属于定量PCR (Q-PCR )的一种,以一定时间内DNA
的增幅量为基础进行DNA 的定量分析。
real time PCR 的定量使用萤光色素,目前有二种方法。一种是在ds DNA (双
链 DNA )中插入特异的萤光色素;另一种使用一种能与增幅DNA 序列中特定寡核酸
序列相结合的一种萤光探针(probe )。
real time PCR 与 reverse transcription PCR (反转录PCR) )相结合,能用微量的
RNA 来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种 RT PCR 的组
合又被称之为“定量 RT-PCR (quantitative RT-PCR )”
RT-PCR 技术相关试剂
oligo: 多聚体,相当于 mRNA 引物
AMV (M-MLV ):逆转录酶
dNTP:脱氧核苷酸
RNase :RNA 酶抑制剂
PCR Buffer :RT-PCR 缓冲液
MgCl2 :2 价镁离子
PCR 各步骤的目的
(一)预变性:
破坏DNA 中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA 充分变性,减少DNA 复
杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组来源的 DNA
模板,最好不要吝啬这个步骤。此外,在一些使用热启动 Taq 酶的反应中,还可激
活 Taq 酶,从而使 PCR 反应得以顺利进行。
(二)变性--退火--延伸循环:
①模板 DNA 的变性:模板DNA 经加热至 93 ℃左右一定时间后,使模板 DNA 双
链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下
轮反应作准备;
②模板 DNA 与引物的退火(复性) :模板DNA 经加热变性成单链后,温度降至
55 ℃左右,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸:DNA 模板-- 引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下,以 dNTP
为
反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模
板 DNA 链互补的半保留复制链。
(三)PCR 仪扩增循环后 72 度延伸 10 分钟
用PCR 仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72 度延伸了 10 分钟的原因:
1.延伸时间取决于待扩增 DNA 片段的长度。(当然是在反应体系一定的条件下)
例如,使用 taqDNA 聚合酶,72 度时的碱基掺入率为 35-100bp/s,因此延伸速率为
1kb/min。
2.根据延伸速率推得,扩增 1kb 以内的dna 片段 1min 即可,而3-4kb 则需要
3-4min ,依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至 4-10min,这样做是
使 pcr 反应完全以提高扩增产量。
3.继续 72 度延伸了 10 分钟除了可以使 pcr 反应完全以提高扩增产量外,还有
一个作用是:在用普通 taq 酶进行 PCR 扩增时在产物末端加 A 尾的作用,可以直接
用于 TA 克隆的进行。
RT-PCR 的注意事项
在做Northern 等杂交实验、构建Cdna(互补DNA)文库、获取能够编码真核生物蛋白
的基因、获得RNA 病毒基因时,会用到RNA 提取和RT-PCR 技术。
真核生物的基因组是DNA,为什么不直接从DNA PCR 得到我们需要的基因呢?因为
真核生物的基因含有大量的非编码区,称为内元(intron),真正编码蛋白的区段是被这些
内元隔开的,这些编码区叫做外元(ex
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