一株高效石油降解菌的筛选及其降解条件优化.doc

一株高效石油降解菌的筛选及其降解条件优化 　　摘要：从中原油田石油污染土壤中分离到一株新的石油降解菌HNAU-1，经16S rDNA测序鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。该菌可以以石油为惟一碳源进行生长，10 d的降解率可达50.7%。单因素试验表明添加其他碳源（葡萄糖、淀粉和蔗糖）均可抑制该菌对石油的降解；以尿素为氮源，35 ℃（25～35 ℃范围内），pH 7.5，盐度为0.5%，十二烷基硫酸钠为表面活性剂均有利于菌株对石油的降解 关键词：微生物；降解；石油；优化；筛选 中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）16-4141-04 DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.017 石油是原油和石油制品的总称，是一种由多种烃类（正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳香烃、多环芳烃）及少量非烃化合物和有机金属组成的复杂混合物。据统计，中国每年约有60万t的石油及其制品通过各种途径进入环境，污染土壤、地下水、河流、海洋[1]。石油烃在环境中的持久性很强，危害性也较大，不仅具有强烈的致癌、致畸和致突变毒性[2-5]，还能通过食物链在动植物体内逐级富集和放大，进而对人体健康造成严重的威胁[6-8]。石油污染也因此引起人们的高度关注 对于环境中的石油污染，目前有物理、化学和生物方法将其去除[9]。物理和化学方法虽然见效快，但是成本较高，而且容易造成二次污染，因此限制了其在环境修复中的应用。生物方法最常见的是采用微生物对石油进行降解，该方法成本较低，而且不会造成二次污染，有望成为具有广阔应用前景的修复方法[10]。但是在中国生物方法并未得到广泛的应用，其原因是降解菌活性不高。本研究从中原油田土壤中筛选得到1株高效石油降解菌，并采用单因素试验对其降解石油的条件进行了优化，有望用于未来石油污染修复中 1 材料与方法 1.1 试验材料 石油污染土壤采自中原油田，用于分离石油降解菌 液体培养基成分为：（NH4）2SO4 0.5 g、NaNO3 0.5 g、MgS047H2O 0.2 g、KH2PO4 1.0 g、NaH2PO4H2O 1.0 g、CaCl2 H2O 0.02 g，用去离子水配制成1 L液体培养基，调节pH 7.0，121 ℃灭菌20 min 固体培养基在液体培养基基础上添加18 g/L琼脂粉，121 ℃灭菌20 min即可 无机盐培养基：葡萄糖5 g、NH4NO3 2 g、K2HPO4 0.5 g、KH2PO4 1 g、MgSO47H2O 0.5 g、无水CaCl2 0.02 g、NaCl 5 g、FeCl36H2O 0.02 g，用去离子水配制成l L液体培养基，105 ℃灭菌20 min 1.2 菌株筛选 取1 g石油污染土壤分别添加到100 mL液体培养基中，避光培养（28 ℃，180 r/min）7 d后，转接于新的液体培养基中继续培养，如此反复5次。取0.1 mL培养液均匀涂布在含固体培养基的平板上，30 ℃避光培养，每天观察菌落生长情况。待菌落长出，挑选形态不同的菌落转接到新的含固体培养基的平板上，如此反复数次，直到形成形态单一的菌落，即为纯化的菌株，4 ℃保存，备用[11] 1.3 菌株鉴定 将纯化后的菌株接种至无机盐培养基培养7 d（28 ℃），观察形态特征，采用DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）提取菌株总DNA；采用引物27F及1492R进行石油降解菌的16S rDNA片段的PCR扩增。PCR反应条件为：94 ℃预变性8 min；94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR产物由北京美亿美生物技术有限公司进行测序，测序结果导入CenBank数据库中，通过Blast进行同源性比较 1.4 石油降解率试验 取1 mL菌液（OD600 nm=0.8）接种至100 mL液体培养基中，建立降解体系并进行培养（30 ℃、180 r/min），10 d后分析降解体系中石油含量，以不接菌的处理作为对照 为研究不同反应条件对菌株降解石油的影响，进行以下5组单因素试验： 1）不同石油浓度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5% 2）不同温度：25、30和35 ℃ 3）不同pH：pH 6.5、7.5和8.5 4）不同盐度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5% 5）不同表面活性剂：0.5%曲拉通X-100（TX-100）、0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）和0.5%吐温-80 1.5 石油含量分析 采用重量法分析石油含量[12