2015版药典无菌检查法与微生物鉴定.ppt

各类微生物的菌落特征 微生物类别 菌落特征 单细胞微生物 菌丝状微生物 细菌 酵母菌 放线菌 霉菌 主要特征 细胞 形态特征 小而均匀、 个别有芽孢 大而分化 细而均匀 粗而分化 相互关系 单个分散或按一定方式排列 单个分散或 假丝状 丝状交织 丝状交织 菌落 含水情况 很湿或较湿 较湿 干燥或较干燥 干燥 外观特征 小而突起 或大而平坦 大而突起 小而紧密 大而疏松 或大而致密 参考特征 菌落透明度 透明或稍透明 稍透明 不透明 不透明 菌落与培养基结合度 不结合 不结合 牢固结合 较牢固结合 菌落的颜色 多样 单调 十分多样 十分多样 菌落正反面颜色差别 相同 相同 一般不同 一般不同 细胞生长速度 一般很快 较快 慢 一般较快 气味 一般有臭味 多带酒香 常有泥腥味 霉味 初筛试验 常规的微生物鉴定，一般要先进行初筛试验确定待检菌的基本微生物特征，将待检菌做初步分类。 常见的初筛试验包括革兰染色、芽孢染色、镜检观察染色结果和细胞形态、重要的生化反应等。 区分葡萄球菌(过氧化氢酶阳性）和链球菌(过氧化氢酶阴性） 过氧化氢酶及过氧化物酶实验： 2H2O2 过氧化氢酶 2H2O+O2 过氧化物酶：RH2+H2O2 过氧化物酶 R+2H2O 阳性：细菌变为黑褐色，有气泡产生； 阴性： 不变色。 阳性 阴性 区分不发酵的革兰阴性杆菌（氧化酶阳性） 和肠道菌（氧化酶阴性） 细胞色素氧化酶实验： 细胞色素C 细胞色素氧化酶 氧化型细胞色素C +对苯二胺 + ? --奈酚 靛酚兰（蓝色） 阳性： 2分钟内生成蓝色为阳性； 阴性：无变化。 阳性 阴性 凝固酶实验：区分凝固酶阴性葡萄球菌（ 可推测为非致病性）和凝固酶阳性葡萄球菌(很可能为致病玻片法性） 。 试管法 柠檬酸盐实验（枸橼酸盐实验）： 一些微生物可以以铵盐作为唯一的氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳源，在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐生成碳酸盐，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色。 阴性 阳性 甲基红实验（MR实验） ： 一些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培养基的pH值下降到4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色反应。 阴性 阳性 V-P实验： 一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一步脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰丁二酮，进而与培养基内蛋白胨中所含的精氨酸的胍基发生反应生成红色化合物。 阴性 阳性 表型微生物鉴定 表型微生物鉴定 在表型鉴定时应注意采用的培养基、培养时间和传代次数对鉴定结果的影响。目前已有的基于碳源利用和生化反应特征的鉴定方法，如气相色谱法分析微生物的脂肪酸特征、MALD1-TOF质谱法分析微生物蛋白等微生物鉴定系统，在进行结果判断时需借助于系统自身的鉴别数据库，还依赖特定的培养基和培养方法以确保鉴定结果的一致性。 生长在固体 培养基上的菌落 全细胞 MALDI-TOF谱图 数据库中参考谱图 输出可信鉴定结果 找到匹配度最可信的谱图 各菌种代表性峰型分布存在显著差异，有助于鉴定各个菌种！ 基因型微生物鉴定 与表型特征不同，微生物基因型通常不受生长培养基或分离物活性的影响，只需分离到纯菌落便可用于分析。 由于大部分微生物物种中核酸序列是高度保守的，所以 DNA- DNA杂交、聚合酶链反应、16S rRNA序 列 和 18S rRNA 序列、多位点序列分型、焦磷酸测序、DNA探针和核糖体分型分析等基因型微生物鉴定方法理论上更值得信赖。 基因型的鉴定可通过DNA杂交、限制性酶切片段图谱 的比较和/ 或D NA探针完成，若 DNA -DNA的杂交亲缘关系大于70%时，表明微生物是同一种属。 基因型微生物鉴定 rRNAs记录了微生物的进化历史，对这些序列进行分析可以对微生物进行系统分类和鉴定。 16S rRNA被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺”，可以作为测量各类生物进化的工具。 rRNA在细胞中含量大(约占细胞中RNA的80%)，也易于提取。 rRNA具有重要且恒定的生理功能。 16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同源分子是18SrRNA)。 16SrRNA分子量大小适中，便于序列分析。 在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲