MTT法小结.ppt

药物的配制 浓度 体积 过滤 细胞数目 6000×100=6×105 细胞体积 200ul ×100=20 ml 细胞密度 0.3 ×105 药物浓度 200 100 50 25 药物体积 15 ×100ul=1.5 ml 半倍稀释 MTT法检测细胞活力 细胞毒性检测 细胞形态学观察 细胞生长状态观察 细胞活性检测 MTT法目的和意义 检测细胞存活和生长情况 用于评价药物产生的细胞毒作用 原理 四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简称MTT 活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。 在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正比。 活细胞+MTT 琥珀酸脱氢酶 紫蓝色结晶物 Formazan 贴壁细胞操作步骤 1.??接种细胞：用0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔5000-6000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积50 ul。 （边缘孔用空白培养基填充）。 2.??培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，每孔加药50 ul，一般设3个复孔。 3. 5%CO2，37℃孵育20小时，倒置显微镜下观察。 4. 每孔加入10ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。 6. 每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）  悬浮细胞操作步骤： 1）调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 lg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照。 2）置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后直接测），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值） 4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。 5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。 MTT的配制 MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。 MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，因为时间较短。 配制MTT时用PBSph=7.4溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。 实验结果统计学处理 所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p0.05时为相差显著，p0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50（半数抑制浓度 ）。或计算抑制率。 OD对照组-OD实验组 细胞死亡率% = OD对照组 ×100 % 注意事项 1．?选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。2．??设空白对照，与试验平行设不加细胞只加