凤尾鸡冠花耐盐突变体的RAPD鉴定.doc

凤尾鸡冠花耐盐突变体的RAPD鉴定 　　摘要：采用RAPD技术对叠氮化钠（NaN3）诱变的凤尾鸡冠花耐盐突变体进行遗传特性分析。结果表明：从98个随机引物中筛选出12条适于凤尾鸡冠花的引物，共扩增出104条带，对照和突变体扩增的总条带数分别为49和55，其中9个引物出现差异条带，3个引物未出现差异性条带，凤尾鸡冠花耐盐突变体与对照差异较大，变异率为31.73%，说明了NaN3能有效诱导凤尾鸡冠花的基因变异 关键词：凤尾鸡冠花；耐盐突变体；RAPD鉴定 基金项目：吉林省教育厅“十二五”科学技术研究（吉教科合字〔2013〕第471号） 中图分类号： S681.3 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.23.048 随机扩增多态性DNA（Random amplifie dpolymorphic DNA，简称RAPD）是建立在PCR基础之上的检测DNA多态性的分子标记技术[1]，其利用PCR随机合成多态性DNA片段，检测被扩增区域内遗传特性变化，该技术的实施不依赖于种属的特异性和基因组的结构，无需制备探针，DNA用量少，分子识别率高，对环境污染小，成本低，已在分类学研究、品种鉴定、遗传作图等方面得到了广泛的应用[2-3]。目前，运用RAPD技术已经成功的发现了众多的突变型[4，5]。试验对NaN3诱变的凤尾鸡冠花耐盐突变体进行RAPD分析，进一步鉴定耐盐突变体的遗传稳定性，为凤尾鸡冠花耐盐新品系的诱变育种奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料及试剂 材料：凤尾鸡冠花组培苗经NaN3诱变初筛获得的耐盐突变体 主要试剂：随机引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×CTAB提取缓冲液、Tris-HCl、0.5 moloL-1 EDTA（pH 8.0）、氯仿-异戊醇（24?U1）、TE溶液、3 moloL-1 NaAC、异丙醇、乙醇、DNA分子量标准等，所有试剂均为分析纯 1.2方法 1.2.1基因组DNA提取及检测 参照赵曦[6]等的CTAB法，以未经处理的凤尾鸡冠花组培苗为对照，分别提取对照和初筛耐盐突变体的基因组DNA，并采用紫外风光光度计法和琼脂糖凝胶电泳法对所提基因组进行鉴定 1.2.2凤尾鸡冠耐盐突变体的RAPD检测 1.2.2.1引物筛选及RAPD反应 从上海生工生物工程技术有限公司购进98个随机引物（10个碱基），以对照和耐盐突变体基因组DNA为模板，进行RAPD扩增，筛选出突变体与对照间具多态性的特异引物 采用20μL的RAPD反应体系，分别为：20ngoμL-1模板DNA 2.0 μL，10pm随机引物1.0 μL，2.5 mmooL-1MgCl2 2.0 μL，2.5 mmooL-1 dNTP 0.3 μL，Taq酶1μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，其余由ddH2O补充。反应程序为： 94 ℃预变性5分钟；94 ℃变性1分钟，35℃退火45秒，72 ℃延伸1 分钟，42 个循环；72 ℃再延伸10分钟；4 ℃保温。扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳分离和分析 1.2.2.2RAPD标记分析 通过筛选引物，检测凤尾鸡冠花耐盐突变体相对于对照在DNA分子水平上的变化，获得突变体与对照间的多态性基因位点，以稳定而清晰的条带作为统计数据，对试验数据进行统计分析，计算变异率[7] 2 结果与分析 2.1基因组DNA的纯度和浓度检测 采用CTAB法提取得到的DNA颜色呈无色透明状，较粘稠，易溶于TE溶液。对照和突变体DNA样品OD260/OD280都在1.80-1.92之间，OD260/OD230都在1.98～2.10之间，表明所提DNA样品中蛋白和RNA污染较少，DNA纯度较高，凝胶电泳结果如图1所示，基因组条带清晰、整齐、明亮，无弥散现象，点样孔清晰，可进行下一步实验 2.2 引物的筛选及RAPD分析 用98个随机引物对凤尾鸡冠花耐盐突变体及其对照进行RAPD分析，结果发现有12条引物可扩增出清晰、明亮、多态性较好的条带（表1），对凤尾鸡冠花对照和初筛获得的耐盐突变体进行了RAPD分析，发现12个随机引物中，9个引物（S87，S88、S89、S97、S113、S424、S432，S435）出现差异条带，3个引物（S98、S117、S440）未出现差异性条带，其余引物均没有扩增出条带，图2为多态性最好的3个随机引物（S87、S432、S435）的扩增图。12个可扩增引物共扩增出104条带，其中对照和突变体分别扩增的总条带数为49和55，扩增片段大小在100-2000bp之间。RAPD扩增结果中出现了新增或缺失条带，与对照相比，突变体新增条带11条，缺失条带12条，凤尾