PCR实验.ppt

经过两年的努力，1985年Mullis发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年。 Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖， Mullis是其中之一。 PCR技术的发展历程 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制。它是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。 二、PCR技术的基本原理 PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C PCR 循环第一步 ——加热变性 靶序列 靶序列 1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； PCR技术的基本原理 PCR 循环第二步——引物与靶序列退火 靶序列 靶序列 Primer 1 Primer 2 Biotin Biotin 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 2.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； PCR技术的基本原理 PCR 循环第三步——引物延伸 靶序列 靶序列 Primer 1 Primer 2 Biotin Biotin 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA Polymerase 3.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 PCR技术的基本原理 第1个 PCR 循环完成后 – 得到两个拷贝的靶序列 靶序列 靶序列 Biotin Biotin PCR技术的基本原理 4.在合适的条件下，这种循环不断重复，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增。理论上讲经过30次扩增反应，DNA扩增倍数为106~109。因此可用微量样品获取目的基因。 PCR技术的基本原理 30次循环后靶序列扩增的数量 No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? PCR基本工作原理 Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 PCR基本工作原理 以上变性、退火、延伸三个过程组成一个循环周期；每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，经过n轮循环后，靶DNA的拷贝数理论上呈2n增长， 一生二，二生四，四生万物。 PCR product PCR技术的基本原理 PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板。 PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。 短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增