微生物细胞的破.ppt

任何破壁方法都有局限性和不足，应根据破壁目的、产物的类型和位置，选用合适的方法，达到选择性地分步释放目标产物的要求。 其一般原则为: 若提取的产物在细胞质内，需用机械破碎法。 若在细胞膜附近则可用较温和的非机械法。 若提取的产物与细胞膜或壁相结合时，可采用机械法和化学法相结合的方法，以促进产物溶解度的提高或缓和操作条件，但保持产物的释放率不变。 总结 选择破碎方法要考虑的因素： 细胞的数量，产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性，破碎程度及破碎速度，希望尽可能采用最温和的方法。 具有大规模应用潜力的生化产品还要选择适合于放大的破碎技术。 ① 多种破碎方法相结合。即机械方法与非机械方法的结合等，如用细胞壁溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，在95MPa压力下匀浆4次，总破碎率可接近100% ,而单独高压匀浆法破碎率只有32% ② 与下游过程相结合。必须从后分离过程的整体来考虑破碎操作，即破碎过程要易于细胞碎片的除净; ③ 与上游过程相结合。细胞的培养过程及其环境条件对细胞的结构及破碎难易有很大影响。 ④ 用基因工程的方法对菌种进行改造。如引入溶解酶的基因讯息，以代替机械破碎法也是非常重要的课题。 为解决破碎过程中敏感性物质的失活，杂蛋白太多以及碎片的去除问题，细胞破碎技术研究还应注意以下问题: 除研究破碎细胞的方法外，还应研究在生物合成过程中减低细胞牢固程度的方法。 例如，发酵过程中改变条件(温度、培养基或加入抗生素等)使某些细菌缺少合成细胞壁的某种组分，它就会从杆状细胞变为丝状细胞，这样就便于用离心分离法收集细胞和进行破碎。 三、破碎率的测定 破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即: Y(%)＝[(N。一N)/N0] 100 由于N0(原始细胞数量)和N (经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量)不能很清楚的确定，因此破碎率的评价非常困难。 目前N。和N主要通过下面的方法获得。 （一）、 直接测定法 利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞数，所以可用于破碎前的细胞计量。可是破碎过程中所释放的物质如DNA和其他聚合物组分会干扰计数，此时可采用染色法把破碎的细胞从未损害的完整细胞中区别开，以便于计数。 例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞呈现亮红色。 （二）、测定释放的蛋白质量或酶的活力 测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中蛋白质的含量或酶的活力，并与100％破碎所获得的标准数值比较； （三）、测定导电率 导电率的变化是由于细胞内含物被释放到水相中而引起的。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。 因为导电率的读数取决于微生物的种类、处理的条件、细胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含量，因此应预先采用其他方法来进行标化。 本章结束 * 缺点： 温度剧烈上升，需冷却。不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却。 不同菌种、超声波处理的效果不同。 杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌容易破碎，对酵母菌的效果极差。 超声波破碎时，影响生物产品收率的因素： 1、温度上升 当气泡破裂时，绝大部分释放出来的能都以热的形式为液体所吸收，为了避免高温，悬浮液应预先冷却到0－5C，并且还应用冷却液连续通入容器夹套，即短期的声波破碎与短期的冷却交替操作，声波破碎/冷却的时间比率称为 “负载因素”。 2、化学效应 超声处理会引起诸如生成游离基这样的化学效应，它可能对某些需要的分子带来破坏性影响，但对破碎细胞毫无影响。 可通过添加游离基清除剂如胱氨酸或谷胱甘肽，或者用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。 由一个带夹套的烧杯组成，其形状和尺寸会影响悬浮液的流体动力学。对于刚性细胞可以添加细小的珠粒，产生辅助的研磨效应。超声波反应器内，有四根内环管，由于声波振荡能量会泵送悬浮液循环，用插入进出口管到内部烧杯去的方法，就可以实现连续操作。 连续超声波破碎的实验室装置 影响超声波破碎效率的参数: (1)、振幅 振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度 k。 (2)、细胞悬浮液的粘度 粘度影响能耗并会抑制空穴现象。 (3)、表面张力 添加表面活性剂或从细胞中释放出表面活性物质(如蛋白质)，能显著地影响声波破碎效率。 因为强烈起泡在气一液界面上会促使蛋白质变性和空穴清除，特别是应用高的功率时。 (4)、被处理悬浮液的体积 大体积需要高的声