第九章外源基因在宿主细胞中的.ppt

Chapter9: High-level expression of foreign genes ;§1.gene silence(基因沉默);;Methylation Induced;;基因表达系统;;一、外源基因在原核细胞中的表达;;（一） 基因表达的调控序列;;;最佳启动子必须具备的条件;;;;;S-D序列(AGGAGG)后面的4个碱基： 如果是A（T）, 翻译效率最高； 如果是G（C）,效率只有50%或25%。 SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3～9个碱基。多数情况下为7bp，此间的碱基多一个或少一个都会影响翻译的起始效率。 ;;;;4、密码子的选择性;（二）外源基因在大肠杆菌表达的形式;;;;融合蛋白与非融合蛋白;;;;;;;;1.非融合型表达蛋白载体pKK223-3 ;2．分泌型克隆表达载体pinⅢ系统  作为分泌克隆表达载体中关键的编码信号肽的序列，是取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa (外膜蛋白基因)。 ;3．融合型蛋白表达载体pGEX系统 ;GST融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖 (Glutathione Sepharose)亲和层析柱分离纯化。 ;;原核细胞高效表达目标基因的战略;（五）原核细胞表达真核基因的缺陷 ;避免外源基因表达蛋白降解的对策：;芽孢杆菌表达系统;1 芽孢杆菌表达载体;表达载体;1.2 宿主菌;外源基因在芽孢杆菌中的分泌表达;链霉菌表达系统;3.1 链霉菌基因表达载体;核糖体结合位点;3.2 宿主菌;二、外源基因在真核细胞中的表达;;（二）提高外源基因在植物中表达的策略 1、启动子优化2、转译序列的修饰 3、构建含 Ｍ Ａ Ｒｓ的表达载体 4、降低外源基因的拷贝数 5、利用引导肽进行表达产物的定位 ;1、启动子优化;;;2、　转译序列的修饰;(2)应用内含子提高基因的表达 (3)改造编码区密码子提高外源基因的表达充分考察受体植物密码子的使用频率; 核基质结合区(Matrix attachment regions)也称核骨架结合区(Scaffold attachment regions)，是存在于真核细胞染色体中的一段与核基质特异结合的DNA序列。 ;;4、降低外源基因的拷贝数;5、利用引导肽进行表达产物的定位;（三）提高外源基因在动物中表达的策略;;酵母表达系统;1 酵母基因表达载体;选择标记;表达盒;2 酵母基因表达载体的种类;着丝粒型质粒载体（yeast centromeric plasmid， YCP）;3 酵母基因表达系统宿主菌;巴斯德毕赤酵母;乳酸克努维酵母;4 在酵母中高效表达外源基因的策略;6 哺乳动物细胞基因表达系统*;哺乳动物基因表达载体组成元件一般包括：;复制子;终止信号和加poly(A)信号;剪接信号;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;6.3.6.2 哺乳动物基因表达载体;6.3.6.3 哺乳动物基因表达宿主细胞;CHO-K1细胞;COS细胞;鼠骨髓瘤细胞;6.4 提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略*;（3）抑制细胞凋亡，延长细胞周期;;