第五讲组培应用.pptVIP

6 解冻 贮藏于液氮中固定样品，缓慢升温时，细胞内会再次结冰，危险区大概在-50~-10度。 实验表明，冰冻过的材料在35~40度水浴中解冻比在室温解冻效果好。 冰冻的材料细胞很脆弱，解冻时应避免剧烈摇动。 7 解冻后的处理 解冻后残留于细胞的冰冻保护剂会影响材料的恢复生长，所以需要除去保护剂； 但是没有必要连续洗涤，多次洗涤对细胞的伤害往往会更大。 8 解冻后活力测定 再培养； FDA染色； TTC染色：检测细胞内脱氢酶活性 人工种子 体细胞胚与人工种子 体细胞胚是由植物体细胞培养产生的类似于合子胚的结构； 把离体培养产生的体细胞胚或能够发育成完整植株的分生组织包埋在含有营养物质和具有保护作用的外壳中，在适宜的条件下就可以长出幼苗，这种类似于天然种子的结构称为人工种子。 人工种子的结构 1 胚状体 类似于天然种子的胚，主要是组培产生的胚状体、愈伤组织、小鳞茎等； 2 人工胚乳 相当于组培中的培养基，提供营养和激素； 3 人工种皮 透水透气，固定成型，耐受机械损伤 人工种子的意义 可以使在自然状态下不结实或种子昂贵的植物得以繁衍； 固定杂种优势； 快捷高效的繁殖方式； 可人为控制植物的生长发育和抗逆性。 人工种子目前只在一些模式生物如胡萝卜、苜蓿等植物中有成功报道； 本节完下节内容 细胞培养及其应用 热处理脱毒处理温度的时间因物种和器官的生理状态而异，一般35~40小时，短则几十分钟，长可达数月。 热处理方法 热水处理： 热水处理对休眠芽效果比较好 热空气处理： 对活跃生长的茎尖效果好，既能消除病毒，也能使寄主植物有较高的存活机率。 把旺盛生长的植物转移到35~40度的热疗室处理一定时间，热处理后要立刻把茎尖切下来嫁接到无病的砧木上。 热处理脱毒的局限性 并非所有的病毒都对热处理敏感； 延长寄主植物的热处理时间，也会钝化植物组织中的抗性因子； 热处理以后仅有一小部分植株能够存活。 脱毒技术2 2 茎尖脱毒培养 植物茎尖不存在病毒，或病毒数量、种类少； 病毒的复制速度不及茎尖细胞的生长速度，病毒难以进入到分生组织中。 茎尖培养是生产无毒植株最重要、最有效的组培方法，在草本植物上广泛应用，在十几种木本植物上也取得了成功。 脱毒培养的方法 1 从带病植株上切取茎尖、芽尖作为外植体，常规消毒后在培养基上培养成小植株，经过脱毒检测以后，将脱毒苗移栽到隔离区种植，作为原种繁殖。 2 愈伤组织脱毒培养 茎尖分生组织培养一个茎尖只能得到一株无毒苗，对繁殖率低的植物而言效率不高，如果先用组织培养产生愈伤组织，再从愈伤组织分化出无病毒植株，效率提高。 愈伤组织脱毒的原因 a，感染病毒的愈伤组织内还存在部分无病毒细胞； b，感染病毒的愈伤组织在分裂过程中产生新的无病毒细胞； c，愈伤组织中细胞之间的胞间联系减少，缺乏输导组织，病毒传导受限； d，通过连续的继代，选择了无病毒的或含有少量病毒的细胞簇。 3 原生质体脱病毒培养 类似于愈伤组织脱毒，Shepard报道得到4140株烟草再生植株，7.5%为无毒植株。 4 繁殖组织脱毒培养 利用花组织培养获得无毒株。 如珠心、胚珠，病毒不能进入珠心和胚珠。 5 茎尖显微嫁接脱毒 木本植物茎尖分生组织脱毒培养屡遭失败，后来提出一种显微嫁接技术。 具体做法： 将砧木种子经消毒后播于MS培养基，生长2周以后，把茎尖分生组织热脱毒后再嫁接到砧木上。 茎尖脱毒的理论基础 茎尖培养之所以能获得无毒苗，是由于病毒在植物体内分布不均匀，在顶端分生组织中是无毒的； 病毒靠维管系统传播移动，分生组织中还没有形成维管束，病毒只能通过胞间连丝移动； 分生组织代谢旺盛，钝化病毒的活性较高； 顶端分生组织高浓度的激素浓度可能会抑制病毒增殖。 茎尖脱毒技术要领 1 茎尖的剥取 消毒后的材料放在解剖镜下，用解剖针或解剖刀把分生组织剥取下来，迅速放入茎尖培养基中。 如果在空气中暴露时间过长，会失水死亡。 剥取茎尖的原则是既要脱掉病毒，又要使茎尖容易成活，一般以0.1mm~1mm之间为宜。 离体茎尖越大越容易成活，但病毒越难根除。 2 选用合适的培养基和激素 茎尖剥离后一般采用低激素浓度的固体培养基； 两阶段培养： 第一阶段，以保证茎尖成活为主要目的； 第二阶段，茎尖成活以后，长至2~3cm时更换培养 基，以提高繁殖系数为主要目的。 3 脱毒苗的移栽 适合脱毒苗移栽的基质有珍珠岩、蛭石、泥沙等的混合物； 幼苗健壮、有良好根系的苗容易成活； 4 脱毒苗的田间管理 脱毒苗移到大田以后，要特别严防病毒的再次感染。 选好种植区，选在地势好，排水良好的地块； 脱毒苗种植需建隔离网室，防止蚜虫进入； 土传病毒还要对土壤进行消毒，周围环境也要整洁； 不在同一块土