微生物学 实验7 土壤中细菌的分离纯化及计数.ppt

实验七土壤中细菌的分离纯化及计数 一、实验目的 1、掌握微生物分离纯化的方法及步骤。 2、掌握平板菌落计数的原则和方法。 二、实验原理 平板菌落计数法根据微生物在固体培养基上所形成的菌落一般由一个细胞繁殖而成的原理进行。即一长成的菌落代表一个活的细胞。计数时先将待测样品作一系列稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，再吸取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养单个细胞繁殖形成菌落，统计菌落数目即可计换算出样品的含菌数。 环境中不同种类的微生物通常混杂生活在一起，为了获得纯种微生物，一般根据该微生物营养或培养特点，制作或设置一些选择性培养基，或选择性培养条件，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法分离，纯化该微生物，直至得到该纯种菌株。 1、牛肉膏蛋白胨培养基、土壤样品、无菌水 2、培养皿、玻璃试管、胶头滴管、涂布棒 三、实验材料 四、实验步骤 1、细菌的分离纯化——稀释涂布平板法 （1）试管和培养皿编号　在试管壁上依次标上10-2、 10-3、10-4、10-5、10-6。在培养皿养皿的底部依次标上10-4-1、 10-4-2 、 10-5-1 10-5-2 、10-6-1、 10-6-2。 　 （2）倒平板　将牛肉膏蛋白胨固体培养基融化（微波炉加热3min-5min），待培养基冷却至不烫手时（约50℃），无菌倒入已编号的培养皿中，室温凝固，备用。 （3）土壤稀释液制备。称取10g土壤至盛有90mL无菌水的三角瓶中，震荡15-20min，静置约20～30秒，即成10-1的土壤悬液。用胶头滴管移取1 mL菌悬液至标有10-2的离心管中，震荡混匀，制成10-2的菌悬液；从10-2管中取1 mL菌悬液至标有10-3的离心管中，震荡混匀，制成10-3的菌悬液；同法依次制备10-4、10-5、10-6的菌悬液。 （5）涂布平板　无菌操作，用胶头滴管分别移取10-4、 10-5、 10-6稀释菌液各200 uL于相应编号的培养皿中，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻涂布均匀。（注意：涂布棒火焰灼烧，冷却后再涂布，否则温度太高导致菌体死亡） 　 （6）培养及计数。将涂布好的平皿放入37℃培养箱中倒置培养。 2、菌落计数 培养48 h后取出培养皿，算出同一稀释度的三个平 皿中平均菌落数，再按公式计算每毫升样品中活菌数。 正置培养过程中，培养基中水分蒸发后，会在培养皿盖上冷凝形成水滴，一方面，水滴滴落至菌落表面，会将菌落打散，不易获得单菌落； 另一方面，皿盖上形成水蒸气不利于结果的观察且容易造成培养基内水分蒸发。所以要进行倒置培养。 平均菌落数——某一稀释度下三个平皿上的菌落平均数； CFU——菌落形成单位（colony-forming units，CFU）； 0.2mL——每个平皿加入的菌悬液体积； 100mL——10-1菌悬液的体积； 10g——称取的土壤重量。 计算公式： 菌落计数原则（六条） 1、先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。 2、首先选择平均菌落数在30～300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该样品的细菌总数（见下表，例1）。 3、若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中稀释度(倍数)较小的计算菌落总数（见下表，例2及例3）。 4、若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度(倍数)最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见下表，例4）。　 5、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度(倍数)最低的平均菌落数乘以稀释倍数（见下表，例5）。 6、若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（见下表，例6）。 计算菌落总数方法举例（加样量为1mL） 例次 不同稀释度的平均菌落数 两个稀释度菌落数之比 菌落总数 （个／mL） 备注 10-1 10-2 10-3 １ 1365 164 20 － 1.64×104 采用科学计数法；取两位小数 ２ 2760 295 46 1.6 3.78 ×104 ３ 2890 271 60 2.2 2.71 ×104 ４ 无法计数 1650 513 － 5.13 ×105 ５ 27 11 5 － 2.70 ×102 ６ 无法计数 305 12 － 3.05 ×104 “无法计数”——指因稀释倍数掌