第三章 生物化学检验常用技术.ppt

* 注意事项 1.实验室的布局要求划分操作区 2.操作人员必须进行上岗培训 3.分装试剂 PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装 4.实验操作注意安全防护 5.标本收集　建立标本收检标准操作程序并对标本采集人员进行培训 6.标本的保存和运输　标本应新鲜，不能立即检测的标本应置－20℃以下保存 第五节 基因扩增技术 利用Taq酶的5′→3′外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针 二、荧光定量PCR基本原理 根据上述原理研制了定量PCR扩增仪，当荧光信号增强到某一阈值（Ct值）就被记录下来。 Ct值与标准模板数量的对数值之间有严格的线性关系，利用系列标准模板的Ct值，制成标准曲线，根据待测样品的Ct值，就可在标准曲线中确定待测样品起始的DNA数量 第五节 基因扩增技术 * ①人类遗传疾病的诊断与研究，如地中海贫血、血友病、苯丙酮尿症等致病基因的检测 ②病原体的检测，包括细菌、病毒、支原体、衣原体以及原虫等的检测，用于传染病的诊断、变异株分析、流行病学研究 ③肿瘤检测，如检测白血病、淋巴瘤、消化道肿瘤等细胞基因的改变 ④其他，如优生检测、法医学等 三、PCR反应技术在临床的应用 第五节 基因扩增技术 * 谢 谢！ 应用Lambert－Beer定律时必须符合3个条件：一是入射光必须为单色光；二是被测样品必须是均匀介质；三是在吸收过程中，吸收物质之间不能发生相互作用。 4．Lambert－Beer定律的偏离现象 （1）Lambert－Beer定律的局限性：它假设吸光粒子之间是无相互作用的，因此仅在稀溶液时下才适用。 （2）非单色入射光引起的偏离：Lambert－Beer定律仅在入射光为单色光时才是正确的，但一般分光光度计中的单色器分出的光束不是严格的单色光，而是具有较窄波长范围的复合光带，这些非单色光会引起Lambert－Beer吸收定律的偏离。为了减少这种误差，通常选择吸光物质的最大吸收波长（λmax）作为测量波长。 （3）光的散射、折射引起的偏离。 （4）溶液本身发生化学变化引起的偏离：由于被测物质在溶液中发生缔合、解离或形成新的化合物等化学原因，使吸光度和浓度不呈线性关系。 （5）仪器因素引起的偏离：仪器光源不稳定、实验条件的偶然变动等，都会导致对Lambert－Beer定律的偏离。 溶剂空白：用纯溶剂（如蒸馏水或其他有机溶剂）不加样品和任何试剂配制的溶液称为溶剂空白。选择原则：当显色剂及其它试剂均无色，被测试样中又无其他有色粒子时，选用空白溶剂参比。 （2）试剂空白：用不加样品（用蒸馏水或其他纯溶剂代替样品），同样加入显色剂和其他所需试剂作为空白溶液，称为试剂空白。选择原则：当显色剂或其它试剂有颜色，而被测试样中又无其他有色粒子时，选用试剂空白参比。 （3）样品空白：与显色反应相同的条件，用不加显色剂的样品溶液称为样品空白。选择原则：当样品基体溶液有颜色，而显色剂无颜色且显色剂也不与样品基体显色时，选用样品空白。 （4）平行操作空白：与样品分析完全相同的操作步骤，用不含待测元素的样品溶液进行平行操作，称平行操作空白。如正常人的血液、脑脊液等不含待测组分的样品按相同的分析条件进行操作所得的溶液即可作平行操作空白。 （5）不显色空白：在有的显色反应中，如改变试剂加入顺序或改变操作条件（如应加热改为不加热），可使显色反应不发生，这样配制的空白溶液中有样品溶液或试剂的颜色，但待测组分未能显色（由于条件改变）即称为不显色空白。选择原则：当显色剂和被测试样均有颜色时，选用不显色空白。 分子、原子或离子在辐射能的作用下，由基态或低能态跃迁到激发态，当它们返回基态或低能态时，以辐射的形式释放出能量，由此而产生的光谱称为发射光谱。 荧光的激发光谱和荧光光谱 固定荧光的发射波长而不断改变激发光（即入射光）的波长，并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱，简称激发光谱。 使激发光的波长和强度保持不变，不断改变荧光的发射波长并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对发射波长的谱图称为荧光的发射光谱，简称发射光谱。 分子、原子或离子在辐射能的作用下，由基态或低能态跃迁到激发态，当它们返回基态或低能态时，以辐射的形式释放出能量，由此而产生的光谱称为发射光谱。 快速、灵敏、准确、仪器简单，价格低廉。 电化学分析法有多种，如测定原电池电动势以求物质含量的分析方法称为电位法或电位分析法；通过测定电阻以求物质含量的分析法称为电导法；而借助某些物理量的突变作为滴定分析终点的指示，则称为电容量分析法等。 干化学分析仪是一种专门使用固相载体试剂进行临床化学检验的分析仪，它通过反射光度法、差示电位法等方法定量测出样品中特定成分的浓度或活度。 一、干化学分析技术的基本原理 、、氯