9经典免疫学试验,沉淀反应.ppt

(3) 方法评价： 敏感度达mg/L水平，可自动化，但反应时间较长 (三) 免疫胶乳比浊法 1. 原理 选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。 2. 操作步骤 1) 用稀释液将待测抗原和抗原标准品稀释。 2) 将抗体致敏胶乳溶液和待测抗原、不同浓度的抗原标准品反应一段时间，测吸光度值。 3) 以抗原标准品量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，查出待测抗原量。 3. 方法评价 敏感度高，试剂稳定，因反应液中无PEG沉淀剂的影响，个体IC对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。 第二节 凝胶内沉淀试验 凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation)主要是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散(gel diffusion)。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀验分为3类：①双相琼脂扩散试验(double gel diffusion test)，②单相琼脂扩散试验(single gel diffusion test)，③凝胶免疫电泳(gel immuno-electrophoresis)。这是一项凝胶内电泳加扩散技术，专门一章介绍。 一、单相琼脂扩散试验 (一) 原理 将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。 (二) 操作步骤 1. 将抗体和0.9%琼脂糖50~56℃混合，即刻倾注成平板。 2. 待凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶液。 3. 置37℃，让其向四周自由扩散，24~48h后可见其孔周围出现沉淀环。 (三) 方法评价 单向琼脂扩散试验是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为1.25mg/L。 (四) 影响因素 1. 抗原分子量 抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。 人民卫生出版社 人民卫生出版社 人民卫生出版社 人民卫生出版社 人民卫生出版社 人民卫生出版社 免疫学检验 第十三章 沉淀反应 可溶性抗原+相应抗体 肉眼可见的沉淀 返回总目录 目　录 1897年 Kraus 就发现细菌培养液（毒素）与相应抗血清混合出现沉淀 1905年 Bechhold 把抗体放在明胶中，将抗原加于其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行 1946年 Oudin 报告了试管免疫扩散技术 1965年 Mancini 提出单向免疫扩散技术，使定性免疫试验向定量化发展免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、微量、自动化的新阶段。 根据沉淀反应的介质和检测方法的不同, 沉淀反应可分为: 液相内的沉淀反应 凝胶内的沉淀反应 第一节 液体内沉淀试验 根据沉淀现象的不同，液体内沉淀又可分为三类： 絮状沉淀 环状沉淀 免疫浊度沉淀 一、絮状沉淀试验 絮状沉淀试验是一项经典实验技术。曾用于测定梅毒抗体的Kahn试验是絮状沉淀的代表试验，现今已被更简便而敏感的USR或RPR方法替代。 (一) 原理 抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。絮状沉淀易受抗原与抗体比例的影响，由此可作为最适比测定的基本方法。 (二) 操作步骤 1. 抗原稀释法 (1) 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。 (2) 各管加入一定浓度的适量抗血清。 (3) 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。 (4) 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。 2. 抗体稀释法 本法采用抗原量恒定与不同倍比稀释度的抗体反应，出现沉淀物最多的管为抗体最适比例管。 3. 方阵滴定法 抗原和抗体同时稀释，亦称棋盘(checkerboard)滴定法，是前二法的结合，可一次完成抗原和抗体的滴定并找出抗原、抗体的最适比。 (三) 方法评价 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，受抗原抗体比例影响非常明显，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。 二、环状沉淀试验 环状沉淀(ring precipita