pcr技术简介(学生版).pptVIP

PCR原理简绍 PCR的扩增过程模拟体内DNA的天然复制过程，利用一种从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶，及碱基互补配对原则。通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的多次循环,最终使基因扩增形成特异区段的DNA带，实现DNA在体外的特异性扩增。 PCR的操作步骤 PCR由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成 变性 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃1min后，模板DNA双链即解离成为单链，以便之后引物结合，为下轮反应作准备 退火 ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至54℃ 45s，以便使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 延伸 ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，DNA序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链 实验室的实际操作 1.设计引物 2.PCR体系配置 3.PCR 4.产物的琼脂糖电泳检测 设计引物 此步骤实际为PCR整个过程中最为关键的一步。 目前一般采用计算机软件设计引物，之后交由生物技术公司对引物进行生产，常用的引物设计软件有Primer Premier5.0 一般的引物设计需要注意遵守的原则 （1）引物长度 一般引物长度不宜太长，应控制在15-40 bp左右，引物长度过长会引起退火时结合的模板数减少，降低反应效率 （2）引物的3‘末端的碱基不能进行修饰 引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般3‘端也不能发生错配 （3）引物的特异性 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性，以免造成不必要的非特异性扩增。 （4）GC的含量 一对引物的GC含量和Tm值应该协调， G+C一般占40-60%。根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,可估计引物的Tm值。 （5）两引物间避免有互补序列 一般来讲，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。 （6）引物内部避免形成二级结构 采用计算机软件可以预测估计mRNA的稳定的二级结构，有助于选择模板。 PCR体系配置及扩增 根据标准体系配置母液，根据实验要求取适量pcr管，取少量模板DNA与母液混合，上加少许石蜡油密封，之后放入PCR仪中，根据预先设定程序反应即可 PCR产物的检测 将扩增后的产物利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，如果在扩增所需的基因分子质量大小处出现较为明亮的亮带，则可大致说明实验成功 在遗传与分子生物学中的应用 1制备与筛选CDNA文库 2直接测定DNA序列 3克隆染色体上特异性片段 4介导与检测基因突变 5克隆未知序列 6寻找新基因 7构建连锁图谱 * * * * * * * * 特定的低纯度标本也可使用 某些靶基因含量高的标本，如人的组织、细胞、毛发、血液、培养后的细菌和病毒等病原体等，DNA粗制品及总RNA即可作为扩增模板，但在具体的扩增时，可对标本进行适当的稀释，在不影响靶基因模板的扩增浓度下，降低标本中PCR抑制物的浓度，以利于靶基因的扩增。 病原体核酸的检测：定量（抗病毒药物治疗疗效监测）；定性（耐药突变、基因分型、血液筛查等）。 遗传病 肿瘤 个体鉴定 其他（SNP及涉及核酸的科研等） PCR技术在医学上的应用 在感染性疾病病原体检测中的应用 病毒的检测 定量(感染状况判断、抗病毒药物治疗疗效监测） 定性(耐药突变、基因分型、血液筛查等） 细菌及其它微生物的检测 难培养菌 耐药基因 寄生虫的检测 α地中海贫血 α地贫的发生是由于α珠蛋白链基因突变的结果，α珠蛋白基因定位于第16染色体短臂，每条染色体上均有两个α珠蛋白基因，该基因总长30Kb，共包含七个连锁的α类基因或假基因。 在α-基因的突变中，以缺失型突变最为常见。α-基因的另一突变即为点突变，目前已发现的突变有18种以上，它包括错义突变、无意突变、剪接部位突变及起始信号突变。 α地贫的产前诊断目前一般采用PCR-探针杂交或限制性长度多态性（RFLP）方法进行。 在遗传病及其它基因相关疾病诊断中的应用 β地中海贫血 β地中海贫血（简称β地贫）:β地贫由β珠蛋白链基因突变所引起，该基因定位于第11染色体短臂，总长度约60Kb，其中有许多胚胎性基因及假基因，而β珠蛋白基因有两个内含子和3个外显子，总长约为1.126Kb. β-基因的突变以点突变为主，亦有碱基的插入和缺