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1.样品制备 二聚体或多聚体：还原变性电泳 蛋白不同剪切体或isoforms :实验论证 蛋白降解：①使用新鲜样品②加蛋白酶抑制剂 上样量过大：减少上样量 2.封闭 封闭不充分：优化封闭时间和浓度 3.抗体孵育和检测 一抗/二抗浓度过高：降低抗体浓度 (主要是一抗) 抗体没有经过纯化:纯化或更换抗体 二抗非特异性结合：使用二抗对照 4.其他 洗膜保证充分 杂带问题 适当稀释一抗提高特异性 适当稀释二抗降低背景 二聚体或亚型 杂 带 目的条带 操作问题 一抗浓度不够:增加一抗浓度 抗体孵育不均匀:摇床 干膜: 保持湿润 细菌污染:①加防腐剂或更换抗体②配制新鲜缓冲液 补丁染色问题 补丁染色 微笑条带：主要由于凝胶中部聚合不完全，多见于较厚凝胶，也可由于上样量过大 室温静置充分凝固；调节上样量 皱眉条带：凝胶和玻璃挡板底部有气泡或凝胶两边聚合不完全或上样量过大①在两板间加入适量缓冲液②完全凝胶③重新配胶④调整上样量 表情条带 单孔皱眉 两边皱眉 微笑条带 单孔微笑 拖尾现象：主要是A.样品融解效果不佳; B.电泳缓冲液时间过长; C.分离胶浓度过大引起①加样前离心 ②加适量样品促溶剂③重配电泳缓冲液④降低凝胶浓度。 弥散现象：样品不溶性颗粒或凝固不充分或制胶问题 ①加样前离心； ②加适量样品促溶剂③ 充分凝固④ 重新配胶⑤更换电泳液。 拖尾及弥散条带 拖尾 弥散 “鬼带” ：A大分子构象复杂蛋白质分子未完全变性或轻微复性；B高含量高纯度蛋白存在充分变性还原；C 抗体的重轻链(①加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；②或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化；③分离或过滤样品；抗体来源) “鬼影” (条带的中心透亮)：上样量过大、目的蛋白过多适当减少上样量 鬼问题 鬼 影 目的条带 鬼带 条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜或蛋白上样不均正确安装、加样、上样均匀 条带两边扩散：加样量过多减少上样量 偏斜与扩散 条带偏斜 条带扩散 溴酚蓝不能起到指示作用(溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象：主要与缓冲液和分离胶的浓度有关①更换正确pH值的Buffer；②降低分离胶的浓度。 较粗条带：样品浓缩不佳或上样量过大①适当增加浓缩胶长度；②保证浓缩胶的pH6.7③适当降低电压④减少上样量； 电泳电压很高而电流却很低：电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）d.上样孔中过多气泡 ①正确装配电泳槽； ②增加电泳液； ③以电泳缓冲液赶走气泡。 浓缩胶与分离胶断裂：①拔梳子用力不均匀或过猛② 封闭下胶的水或正丁醇未弃净 ①温柔拔梳； ②弃净上胶部液体③重新配胶 板间气泡： a.解除制胶夹后，板未压紧而致空气进入;b.解除制胶夹,用力过大 ①温柔并正确操作；②气泡大时重新配胶 其它问题 1. Transfer the protein (dry hydrophobic state, antibady binding, eliminate blocking or lengthy wash steps) 2. Dry the membrane ( wet 100% methanol for 5 min; dry for 15 min) 3.1st-antibody for 1 h (1%BSA; 1%Tween-20; TBST ) 4. Wash the blot in TBST three times, 5min/time 5. 2nd-antibody for 1h (1%BSA; 1%Tween-20; TBST ) 6. Wash the blot in TBST three times, 5min/time 7. Add the substrate and expose in dark place Antibody source; buffer composition; incubation times; PVDF membrane(RP562) Combine with the regular immunodetectoin A rapid immunodetection * 是检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，如果一个实验连内参照都出不料阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下），那么这个体系就是存在问题的了 半定量的标准：内参一般选择的管家基因编码表达的蛋白，在很多组织和细胞中中都是稳定表达的，因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准。 * * Western blot 实验技术