高效液相色谱-03详解.ppt

第七章液相色谱分析法 一、液相色谱固定相 stationary phase of HPLC 二、液相色谱流动相 mobile phase of HPLC 一、液相色谱固定相 stationary phases of LC （3）化学键合固定相 化学键合相 化学键合相 化学键合相 1. 非极性键合相：十八烷基硅烷键合相(ODS)是最常用的非极性键合相。 （二）.液-固吸附分离固定相 液－固色谱固定相 （三）.离子交换色谱分离固定相 （四）. 空间排阻分离固定相 (五)色谱柱-结构 色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。 　　色谱填料： 经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10粒径的球形颗粒。 　　色谱柱管： 内部抛光的不锈钢管。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。 　　色谱柱： 也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的,其结构如图所示。 (五)色谱柱-色谱柱装填 干法填充： 在硬台面上铺上软垫，将空柱管上端打开垂直放在软垫上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直台面墩10-20次。 湿法填充： 又称淤浆填充法，使用专门的填充装置（图8-9）。 (五)色谱柱-使用和维护 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。 ①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 ②一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则 反冲会迅速降低柱效。 ③选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。 ④避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。 ⑤保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 ⑥色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。 (五)色谱柱-填料的结构 色谱填料是由基质和功能层两部分构成。 　　基质： 又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一定的刚性，能承受一定的压力，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球。 　　功能层： 是通过化学或物理的方法固定在基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。如图8-10是硅胶基质的冠醚大分子固定相的结构示意图，功能层冠醚分子吸附或键合在硅胶基质的表面。 (五)色谱柱-填料的结构4.26 填料的物理结构： 分为微孔型（或凝胶型）、大孔型（全多孔型）、薄壳型和表面多孔型四种类型，如图8-11所示。 二、液相色谱的流动相 mobile phases of LC 2. 流动相类别 3.流动相的选择 ①样品易溶，且溶解度尽可能大。 ②化学性质稳定，不损坏柱子。 ③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。 ④粘度低，流动性好。 ⑤易于从其中回收样品。 ⑥无毒或低毒，易于操作。 ⑦易于制成高纯度，即色谱纯。 ⑧废液易处理，不污染环境。 3. 流动相选择 4. 选择流动相时应注意的几个问题 5 分离方程式 分离度受三项因素左右：a项由色谱柱的质量决定；b、c两项由流动相决定。相对保留值r与容量因子k虽然相互关联，但溶剂的种类主要改变r。这是因为溶剂的种类不同，分子间的作用力的性质、强度不同，选择性不同。在溶剂种类确定以后，配比的调整只是改变极性，改变洗脱能力，改变保留时间，而分子间作用力的性质不变 ，因此主要是改变容量因子k。概括为：溶剂种类主要影响相对保留值r(主要改变峰间距)，溶剂配比主要影响容量因子k(主要改变保留时间)。 6 Snyder溶剂分类 6 正相洗脱与反相洗脱 7 洗脱方式 7 洗脱方式 梯度洗脱的实质：是通过不断地变化流动相的浓度配比，来调整混合样品中各组分的K值，使所有谱带都以最佳平均K值通过色谱柱。 比较梯度洗脱与程序升温：在梯度洗脱中溶质K值的变化是通过溶剂的极性、pH值和离子强度来实现的，用于分离组分性质差别较大的复杂样品；而程序升温是借改变温度来影响溶质的K值，用于分离宽沸程的混合样品。 优点：①缩短分析周期；②提高分离效果；③改善峰形，很少拖尾；④增加检测灵敏度。 8 流动相溶剂的选择 8 流动相溶剂的选择 ⑶ 高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶