高效液相色谱检测技术.ppt

测样前的准备 开启仪器。将逆时针将Purge阀旋转180度。启动高压输液泵，以5ml/min的流速冲洗3~5min以除去管路中的气泡。 打开紫外检测器，监测基线，至少使之平衡半小时。 切换至所需的色谱条件直到基线平稳之后再进样。 一定要采用进口的进样针！ 具体操作再进行详细培训。 测样后冲洗色谱柱 每天测完样品后必须冲洗色谱柱！ 常用的反相色谱柱的冲洗方法为：以甲醇（或乙腈）：水＝10：90冲洗色谱柱约20min，再过滤至纯甲醇（或乙腈）冲洗至少30min。直至基线平稳后至少15min. 如果使用缓冲盐为流动相的组份之一，应在检测时即开启在线清洗柱塞杆的功能。冲洗色谱柱时应以甲醇（或乙腈）：水＝10：90先冲洗30min至1h之后再过渡至纯甲醇（或乙腈）冲柱。 维护注意事项 在检测时要注意仪器是否有异常声响？ 监测柱压、柱温、流速的变化。 如有异常，应采取相应措施。如：停机。 故障情况应及时向主管老师报告。 谢 谢～ 共用一个机箱的串联式二元高压输液泵 （典型代表是安捷伦） 安捷伦1200内部构造 二元高压输液泵的HPLC（Agilent） 并联式二元高压输液泵 这种形式的输液泵制造工艺要求比串联泵更高。 Waters公司是以做并联泵为主要产品的。 岛津近期也推出了并联泵产品，如：LC-20AD 国产HPLC中只有极少数厂家生产：如：上海伍丰、江苏天瑞等。 二元高压并联泵HPLC结构示意图 贮液瓶 高压输液泵 脱气机 检测器 色谱柱 柱温箱 混合器 进样器 电 脑 废液瓶 并联泵结构的高效液相 四流路单高压输液泵的HPLC（典型代表为安捷伦） 二元高压并联泵HPLC结构示意图 贮液瓶 高压输液泵 电磁阀 检测器 色谱柱 柱温箱 混合器 进样器 电 脑 废液瓶 脱气机 安捷伦1100整体结构 安捷伦1100内部构造 四元低压单泵的HPLC（Agilent） 高压输液泵 电磁阀（含四个流路） 分析部分 分析部分主要就是由检测器组成。 常用的检测器有紫外检测器、差示折光检测器、荧光检测器、蒸发－光散射检测器等。 紫外检测器最为常用。它又可分为可变波长检测器（VWD）和二极管阵列检测器（PDA）。 紫外检测器（外观） 紫外检测器（内部） 流通池 紫外可见波长检测器示意图 紫外可见波长检测器获得的色谱图 光电二极管阵列（DAD）检测器 DAD检测器仍然属于紫外检测器。 与普通紫外可见波长检测器不同的是，它的二极管有512个，可同时采集不同波长下的紫外吸收信号。 普通紫外可见波长检测器是先分光，再通过流通池。DAD是混合光先通过流通池，再分光。 光电二极管阵列检测器（DAD） DAD 检测器 DAD检测器可作三维色谱图 DAD检测器与普通紫外检测器的对比 DAD检测器能在检测色谱峰的同时获得光谱，便于定性。 普通紫外是先分光，再通过流通池，因为是单束光，所以灵敏度高。 DAD检测器是先通过流通池，再分光，因为是混合光，所以灵敏度低。一般比普通紫外灵敏底低一个数量级！ 差示折光检测器 （主要用于无紫外吸收的糖类检测） 控制部分 控制部分主要就是工作站。工作站由硬件和软件两部分组成。 硬件一般是一块可双向传输数据的板卡，安装于电脑主机上。 软件则是与相应机型配套的程序。 有一些软件还要一个“加密狗”，外形类似于U盘。没有“加密狗”，软件就不能运行。 HPLC操作注意事项 使用HPLC之前必须熟悉相关基础知识。包括仪器构造、流动相的选择、色谱柱的保养等。 必须经过培训方可独立操作 做HPLC的“四项基本原则” 流动相和样品必须微孔滤膜过滤！ 开机初始一定要排除流动相气泡！ 　 检测前一定要平衡仪器！ 测完样品一定要冲洗色谱柱！ 坚持这四项基本原则，液相一般不会出现重大问题～ 流动相的选择 不同的液相流动相不同。主要是根据色谱柱和检测器来选择。千万不要认为所有液相的流动相是通用的！ 以常用的紫外检测器反相高效液相色谱为例，常用的流动相为甲醇、乙腈及水或缓冲盐。 思考：为何选择甲醇、乙腈为流动相？ 流动相用缓冲盐注意事项 缓冲盐易于在柱塞杆上析出，对柱塞杆及柱塞杆密封圈磨损极大，如果没有及时清洗，会导到高压输液泵漏液！ 除非万不得已，尽量不用缓冲盐。 如果要用缓冲盐，尽量用挥发性缓冲盐（如：醋酸－醋酸铵），不要用非挥发性缓冲盐（如：磷酸缓冲盐）。 人造宝石材质 柱塞杆密封圈（俗称“黑草帽”） 流动相的过滤 流动相必须用0.22um的微孔滤膜过滤． 微孔滤膜有两种，一种为有机相使用的，另一种为水相使用的，不可混用！ 有机相的膜一般为尼龙膜，水相的膜一般为混合醋酸纤维素酯膜。 用于流动相过滤的滤膜直径为50mm。 流动相过滤装置 样品的过滤 样品必须用0.22um的微孔滤膜过滤． 微