第四组实验策画.doc

镉对小鼠肾脏的急性毒性作用实验设计 （成员：余方琳、罗亚娟、王宝美、蔡陈华、蓝雪梅、王祥清） 一、目的意义： 1、观察氯化镉(CdCl2)溶液对鼠的急性毒性。 镉(Cadmium，Cd)是一种银白色重金属，质地柔软,富有延展性,抗腐蚀、耐磨,广泛并持久存在于工业与环境中,肾脏是镉最重要的蓄积部位和靶器官,一般认为镉所致的肾损伤是不可逆的。镉所致的肾损伤是由在肝脏形成的镉金属硫蛋白(MT)复合物(Cd-MT)引起的。进入人体内的镉,在肝脏中诱导MT的合成并与之结合成Cd-MT,该复合物可通过血液运输到肾脏,经肾小球滤过后大部分被肾小管重吸收,通过胞饮作用,Cd-MT进入肾小管细胞溶酶体,在溶酶体中降解,分离并释放出游离镉产生毒性。一次注射Cd-MT主要造成肾小管细胞的坏死；而慢性镉污染造成的损伤可波及整个肾脏,包括肾单位主要的重吸收部分和滤过部分,而结构和功能的损害与食入剂量有明显的依赖关系。当肾小球滤过率下降到正常的50%以上时，血肌酐才开始迅速上升，因此当血肌酐明显高于正常时，常表示肾功能已严重损害。尿微量蛋白测定是近年来检测肾小球、肾小管功能的主要手段主要包括检测IgG、TRf、ALB、NAG、α1-MG等其中前3项主要反映肾小球功能后2项反映肾小管受损情况。如IgG、ALB分别为大、中分子蛋白质正常情况下绝大部分不能通过肾小球滤过膜屏障。当肾小球滤过屏障受损时便出现ALB排出增加。当肾小球病变发展到一定程度时IgG亦会在尿中出现。TRf分子质量直径大小与白蛋白接近但带负电荷相对比白蛋白少。当肾小球基底膜的电荷屏障发生损害后、TRf比白蛋白更易漏出所以TRf是一项更能反映肾小球滤过膜损害的灵敏指标但尿中浓度相对比白蛋白低很多小鼠肌酐ELISA试剂盒用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。  三、实验仪器与试剂： 1、氯化镉（CdCl2、AR）、蒸馏水、0.9%生理盐水 2、小鼠肌酐ELISA试剂盒? 酶联板(Assay plate )：一块(96孔)标准品(Standard)：2瓶(冻干品)样品稀释液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent)：1×10ml/瓶辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液?(HRP-avidin Diluent)：1×10ml/瓶生物素标记抗体(Biotin-antibody)：1×120μl/瓶(1：100)辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin)：1×120μl/瓶(1：100)底物溶液(TMB Substrate)：1×10ml/瓶浓洗涤液(Wash Buffer)：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍终止液(Stop Solution)：1×10ml/瓶(2N H2SO4)48孔配置96孔配置封板膜酶标包被板 1×48 1×962-8℃保存标准品540μg/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 标准品稀释液1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶终止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶浓缩洗涤液 20ml×20倍×1瓶 20ml×30倍×1瓶 标准规格酶标仪高速离心机电热恒温培养箱干净的试管Eppendof管系列可调节移液器及吸头容量瓶如果最大剂量组有死亡没全死，应加大剂量找出全死剂量，如果全没死，则应考虑做最大耐受量。血清：全血标本请于室温放置2小时后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测。 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37反应120分钟。 为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl(取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37,60分钟。 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100μl，37，60分钟。 温育60分钟后，