1 蛋白质的结构及功能.ppt

（四）蛋白质的紫外吸收 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。 （五）蛋白质的呈色反应 ⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 蓝紫色 ⒉双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。 二、蛋白质的分离和纯化 （一）透析及超滤法 * 透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。 * 超滤法：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。 （二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 *盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 （三）电泳 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。 几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳：是蛋白质组学研究的重要技术。 （四）层析 层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 * 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析：利用各蛋白质分子大小不同分离。 （五）超速离心 * 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 三、多肽链中氨基酸序列分析 1. 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 2. 测定多肽链的N端与C端的氨基酸残基 3. 把肽链水解成片段，分别进行分析 4. 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 5. 经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 （一）改进的Sanger法 水解肽链的方法及特征 裂解剂 裂解位点 胰蛋白酶 Lys、Arg（C） 胰凝乳蛋白酶 Phe、Tyr、Trp（C） 弹性蛋白酶 Ala、Gly、Ser、Val（C） 胃蛋白酶 Phe、Trp、Tyr（N） 溴化氰 Met（C） 羟胺 Asn—Gly 通过核酸推演的方法 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 血红蛋白（Hb）的四级结构 血红蛋白的一、二、三、四级结构 一级结构：相邻AA间的共价结合 二级结构：短距离AA之间的非共价连接 三级结构：远距离AA之间的非共价连接 四级结构：多肽链之间的非共价连接 含有二条以上多肽链的蛋白质一定具有四级结构。 亚基之间的结合主要是氢键和离子键（非共价键） 只有一条多肽链的蛋白质肯定没有四级结构。 多分子聚合物不属于四级结构 蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein 第 三 节 （一）一级结构是空间构象的基础 一、蛋白质一级结构与功能的关系 牛核糖核酸酶的一级结构 二硫键 天然状态，有催化活性 尿素、β-巯基乙醇 去除尿素、 β-巯基乙醇 非折叠状态，无活性 （二）一级结构与功能的关系 例：镰刀形红细胞贫血（Sickle Cell Anemia） N-Val · His · Leu · Thr · Pro · Glu · Glu · · · · ·C(146) HbS β 肽链 HbA β 肽 链 N-Val · His · Leu · Thr · Pro · Val · Glu · · · · ·C(146) 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”