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Chapter 2 细胞生物学研究方法 纲 要 2.1 显微成像技术 2.2 细胞化学技术 2.3 细胞分选技术 2.4 细胞工程技术 2.5 分离技术 2.6 分子生物学方法 2.1 显微成像技术 2.1.1 光学显微镜 ?焦距(focal length)：是透镜的中心平面到焦点的距离 。 ?角孔径(angular aperture)：是光从样品进入显微镜的物镜半角α，因此角孔径实际表示有多少光离开样品通过透镜， 最好的光学显微镜的角孔径大约是70度。 r=0.61λ/ n sinα 其中：n=聚光镜和物镜之间介质的折射率, 空气为1, 油为1.5; 　　　α=样品对物镜角孔径的半角 　　　λ=照明光源的波长。 　　　0.61是一个恒定的参数 2.1.2 常用光学显微镜 ◆普通双筒显微镜 (binocular microscope) ◆荧光显微镜 (fluorescence microscope) ◆相差显微镜 (phase contrast microscope) ◆暗视野显微镜(dark field microscope) ◆倒置显微镜(inverted microscope) 荧光显微镜(fluorescence microscope) 荧光显微镜以紫外线为光源照射被检物体， 使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形态及其所在位置。 要求：被检物体发荧光（自发荧光、诱发荧光） 用途：用于研究细胞内物质的吸收、运输及化学物质的分布和定位等。 相差显微镜(phase contrast microscope) 优点：能够观察无色、透明、活细胞中的结构。 特点：能将物体本身的相位差（光程差）转换为振幅（光强度）变化的显微镜。 暗视野显微镜(dark field microscope) 利用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大，在黑暗的背景下呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高。 用途：用以观察未经染色的活体或胶体粒子。 特点：主要观察的是物体的轮廓，分辨不清内部的微细结构。 倒置显微镜(inverted microscope) 物镜与照明系统的位置颠倒过来。 物镜置于载物台之下， 光源位于载物台的上方。 集光器与载物台之间的工作距离提高， 可以放置培养皿、培养瓶等容器， 直接对培养的细胞进行照明和观察。 2.1.3 光学显微镜的样品制备 1. 样品的固定(fixation) ● 目的: ● 做法: ●固定液： 2. 包埋和切片(embedding and sectioning) 包埋：通常用液态的石蜡或树脂做包埋剂，使之渗入整块组织，使之硬化成固体的包埋块。 切片机切割包埋块，制备成薄切片。适用于光学显微镜观察的切片厚度为 l～10 μm。 3. 染色(staining) 目的：给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征。 苏木精(hematoxylin)：核酸 伊红(eosin)：细胞质 苏丹染料(Sudan dyes)：脂肪 4. 放射自显影 用感光胶片测定细胞内某种被放射性标记的物质在细胞固定时所在的位置。 2.1.4 电子显微镜(electron microscope) 1. 透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM) 让电子束穿透样片而成像。 2. 扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM) 用二次电子成像来观察样品的表面结构。 2.1.5 电子显微镜的样品制备 ?与光镜相比，组织固定的特殊要求： 样品要薄，制成50～100nm的超薄切片。 保持样品的精细结构。 样品要具有一定的反差。 电子显微镜的样品切片最后被放置在载网上而不是玻片上。 1.负染色(negative stainning) 用重金属作染色剂，对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。这样，在图像中背景是黑暗的，而未包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染色。 2. 喷镀技术 是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法。 电镜与光镜的比较 2.2 细胞化学技术 ◆ 酶细胞化学技术：通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。 ◆ 免疫细胞化学技术：利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。 免疫荧光技术 免疫电镜 Figure 9-16. Indirect immuno-cytochemistry. This de