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七、高效液相色谱分离模式 基于极性的分离 正相高效液相色谱 图 S -1 代表三个染料混合物的正相色谱分离。极性的固定相最强地保留了极性的黄色染料。相对非极性的蓝色染料在非极性溶剂的流动相保留竞争中胜出，很快被洗脱出来。由于蓝色染料最像流动相[两者都是非极性]，它流动得更快。对硅胶柱正相色谱来说，典型的情况流动相是100% 极性较小的有机相，不含水。 样品是极性小的先出峰 图 S -1: 正相色谱法 七、高效液相色谱分离模式 基于极性的分离 反相高效液相色谱（最常用） 反相是指与正相恰好相反的色谱模式，即使用极性流动相和非极性[疏水性如C18]固定相。图 S-2 描述了三种染料的黑色混合物被该种方法分离的过程。 样品是极性大的先出峰 图 S -1: 反相色谱法 七、高效液相色谱分离模式 基于电荷的分离: 离子交换色谱[IEC]离子交换分离的固定相以表面酸碱性强弱和吸附保留的离子类型来划分。阳离子交换是用负电荷表面来保留和分离带正电荷的离子。反之亦然，阴离子交换是用正电荷表面来保留和分离带负电荷的离子。 离子抑制色谱法： 通常改变流动相的pH值被中和，使其失去吸附力而被洗脱 。 使用条件应在填料基质的范围内，硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内。 七、高效液相色谱分离模式 基于尺寸大小的分离： 排阻色谱[SEC] - 凝胶渗透色谱[GPC]十九世纪五十年代，Porath 和 Flodin发现生物分子可以通过过滤或流经孔径可控的亲水右旋糖苷聚合物时按照大小被分开，而不是基于电荷数或极性。这个过程被称为凝胶过滤。后来，一种类似的装置，使用特定孔径范围的有机聚合物填料可分离合成寡聚物和多聚物。这个过程成为凝胶渗透色谱[GPC]。使用孔径可控的硅胶填料操作类似的分离过程被称作排阻色谱[SEC]。 八、液相色谱分析方法的建立 1 . 色谱柱的选择： 　　疏水性的样品——反相键合色谱； 　　亲水性的样品——正相键合色谱； 　　生物大分子 ——体积排阻色谱； 　　无机离子化合物——离子对色谱； 　　高分子聚合 ——凝胶色谱； 　　同系物的分离——吸附、分配和键合色谱； 　　同分异构体　—— 双键或取代基异构用吸附色谱； 　　　　　　　 —— 多环芳烃异构选用反相键合； 　　对映异构体 —— 流动相加入手性选择剂或具有光学活性的固定相。 八、液相色谱分析方法的建立 2.流动相、配比、流量、梯度洗脱的选择： 根据分析样品的结构、性质，结合色谱分析法确定流动相。 为达到较好的分离效果，确定流动相配比。 流动相的总流量增加，通常柱效增加。 梯度洗脱--------在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成，来改善分析效果的技术。适用范围：当样品中溶质组分较多及不同溶质的性质差别较大时。 特殊要求：当分析弱酸、弱碱性化合物时，可通过采用缓冲溶液及调节流动相的Ph值来改善峰型。 九、样品分析方法介绍 1 流动相的准备 　　 流动相的选择------有机相（色谱级甲醇、色谱级乙腈）与水（超纯水、缓冲溶液） 　　流动相的过滤------用孔径为0.45μm滤膜过滤除去固体颗粒杂质。 　　流动相的脱气------超声脱气、吹氦脱气、加热回流法、抽真空脱气法、在线真空脱气法。 2 样品的准备 　　称量、用流动相超声溶解、过滤。 九、样品分析方法介绍 3 分析方法的设定（参考相关文献） 流动相的配比及流量------选择何种有机相，纯水或缓冲溶液，有机相与水相的比例，流动相的总流量。 　　　紫外检测波长的确定------通过测定被分析样品的最大吸收波长（紫外吸收检测器）。 　　　是否采用梯度洗脱，确定起始配比（如20∶80)及终点配比(如80∶20)。 九、样品分析方法介绍 4 样品的分析 选定分析条件，走基线； 待基线平稳后，发出进样指令； 用进样针吸取已过滤好的定量样品； 进样分析，获得色谱图及分析结果； 如谱图效果不佳，则改变条件后继续分析。 十、柱的使用和维护注意事项 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。 1.　避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。 2.　应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。 3.　一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 4.　选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固