慢性乙肝患者血清HBVcccDNA检测的临床意义作者.doc

慢性乙肝患者血清H B V c c c D N A 检测的临床意义作者：编辑 时间：2013-01-29 10:42 点击：57 慢性乙肝患者血清H B V c c c D N A 检测的临床意义 摘要：目的 探讨慢性乙肝患者血清HBV cccDNA与现有血清学指标(AST、ALT、TBIL、HBeAg、HBV DNA)的相关性。方法 选取309医院2009年5月-2012年5月就诊的慢性乙肝患者58例，采用Roche C6000电化学发光法检测HBeAg；日立Hi7600全自动生化分析仪检测ALT、AST、TBIL；采用实时荧光定量PCR检测血清HBV DNA、HBV cccDNA载量。结果 血清HBV cccDNA与HBV DNA有很好的相关性(r=0.880，P=0.000)。HBeAg阳性组HBV cccDNA阳性的比例为 67.6%，显著高于HBeAg阴性组的37.5%(χ2=5.170，P=0.023)。血清HBV cccDNA与肝组织炎症的严重程度呈正相关(χ2=4.819，P=0.028)。结论 血清HBV cccDNA定量检测是评价HBV复制情况和肝细胞损伤程度的较为可靠的指标。 关键词：慢性乙型肝炎；共价闭合环状DNA；HBV DNA；乙肝e抗原；谷丙转氨酶 目前慢性乙肝的实验室检查常采用免疫学指标HBeAg、HBV DNA反映病毒复制情况，其特 异性好但灵敏度相对较低；采用生化指标ALT、AST、TBIL反映肝细胞损伤程度，其灵敏度好但特异性相对较差。共价闭合环状DNA(cccDNA)是HBV基因组复制中间体mRNA和前基因组RNA的模板，可长期存在于细胞核中，是HBV持续染的关键，也是乙肝慢性化的主要原因[1-2]。当肝细胞变性坏死时，肝细胞核内的cccDNA可释放入血。有研究表明血清cccDNA与肝内cccDNA有非常好的相关性[3]，且血清cccDNA可反映肝细胞损伤的严重程度。本文通过对58例慢性乙型肝炎患者血清HBV cccDNA与现有血清学指标的相关性分析，探讨其在慢性乙肝患者病毒复制和肝细胞损伤评价中的意义。 材料和方法 1 标本采集及保存　标本来自309医院2009年5月-2012年5月58例门诊和住院慢性乙肝患者，其中男48例，女10例。年龄18-80岁，平均46.25岁。诊断符合2010年修订的《慢性乙型肝炎防治指南》 [4]，排除甲、丙、丁、戊型肝炎和其他原因所致的肝损害。依据肝组织切片的病理组织学结果将肝组织炎症分为轻度(G1-2)、中度至重度(G3-4)。诊断标准见《病毒性肝炎防治方案》[5]。抽取患者空腹静脉血5ml，待完全凝固后3 000r/min离心10min，分离血清置-80℃冰箱保存。 2 主要仪器与试剂　1)仪器：德国艾本德股份公司(Eppendorf)的Mastercycler ep realplex实时荧光子生物学检验。定量PCR仪，罗氏公司的C6000免疫分析仪，日立Hi7600全自动生化分析仪。2)试剂：北京索奥生物医药科技有限公司的乙型肝炎病毒cccDNA核酸扩增检测试剂盒检测HBV cccDNA；上海复兴公司的乙肝病毒核酸定量检测试剂盒(PCR－荧光探 针法)检测HBV DNA；上海罗氏诊断产品有限公司的乙型肝炎病毒HBeAg检测试剂盒(电化学发光法)检测HBeAg；北京莱帮生物技术有限公司测定试剂盒检测AST、ALT、TBIL。 3 HBV cccDNA的试剂准备　从试剂盒中取出HBV-cPCR MIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀。按样本数(血清标本+阴性对照+阳性对照+标准品)N取HBV cccDNA PCR反应液n×24μl、Taq酶n×2μl，充分混匀，10 000r/min离心10s。按每管26μl加入0.2ml离心反应管中。 4 HBV DNA的试剂准备　从试剂盒中取出HBV-PCR缓冲液、Taq酶系、荧光探针、MgCl2。室温融化并振荡混匀10s。按样本数(血清标本+阴性对照+阳性对照+标准品)N取HBV PCR反应液n×18μl、Taq酶n×2μl、荧光探针n×3μl、MgCl2 n×3μl，充分混匀，10 000r/min离心10s。按每管26μl加入0.2ml离心反应管中。 5 模板的提取　取50μl待检血清标本(冻存血清使用前在室温融解，并充分混匀)分别加入50μl核酸提取液A，振荡混匀10s，13 000r/min离心10min。弃去上清95μl，分别加50μl核酸提取液B至沉淀中，振荡混匀10s，100℃恒温10min，13 000rpm离心3min，上清即为模板。 6 HBV cccDNA标准品的配制　HBV-c阳性定量标准品用阴性质控品梯度稀释10倍、100倍、1 000倍，记为