抑制性消减杂交技术主要包括如下几个基本步骤.doc

抑制性消减杂交技术主要包括如下几个基本步骤： （1）双链cDNA合成与酶切：分别提取待比较的两组细胞mRNA（实验方tester、驱赶方driver），利用随机引物反转录为双链cDNA后，用四碱基识别酶如RsaI或HindⅢ切割成平均大小为600 bp左右的平端片段；该酶约在44=256 bp处就有一个切点，一分子而来的双链cDNA经该酶酶切后，可产生数个片段，每个片段一般＜600bp，可防止长链cDNA片段所形成的复杂结构对有效消减杂交的干扰。 （2）两次消减杂交：将tester cDNA分为两组，分别于其5端上接上两种不同的具有一段反向末端重复序列的寡聚核苷酸、去磷酸化接头（adaptor1, adaptor2），以利于随后的选择性扩增。接头设计特点：①接头是由一长链（约40余个核苷酸）和一短链（约10余个核苷酸）组成的一端是平端的双链DNA片段，而且双链的5′均无磷酸基团，保证了接头以唯一方向与cDNA片段连接，即接头长链的3′端与cDNA双链5′端连接；②接头长链外侧（约20余个核苷酸）序列与第一次PCR引物序列相同，内侧序列与第二次PCR引物序列相同；③在接头上含有T7启动子序列，并且含有内切酶识别位点，为以后该片段插入克隆载体提供酶切位点。两组tester cDNA样品分别与过量的driver cDNA进行第一次杂交，得到a、b、c、d四型分子，使原来丰度不同的单链cDNA得到大量富集，两组产物另加上新变性的drvier cDNA再次杂交，这样就产生了两个5端有两个不同接头的e型分子，这种e型分子正是tester较driver特异表达cDNA，填平粘性末端。 第一次杂交中，将过量的driver cDNA分别加入两份tester cDNA中，变性后退火杂交。第一次杂交后有4种产物a、b、c、d：a是单链tester cDNA；b是自身退火的tester cDNA双链；c是tester和driver的异源双链；d是driver cDNA。第一次杂交是使tester单链cDNA均等化，即是原来有丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致。这种均等化的实现是依据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA。同时，由于tester cDNA中和driver cDNA序列相似的片段大都和driver形成异源双链分子c，使tester cDNA中的差异表达基因的目标cDNA得到大量富集。 第一次杂交后，合并两份杂交产物，另加上新的变性driver单链，再次杂交退火。在这一次杂交中，只有第一次杂交后剩余的经均等化和消减的单链tester cDNA能与driver cDNA一起形成各种双链分子。这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA，并产生了一种新的双链分子e，这种分子的两个5′端有两个不同的接头（接头1和接头2），正是由于这两个不同的接头，使其能在以后的PCR中被有效的扩增。 （3）两轮抑制性PCR：两次杂交后，填平粘性末端，利用巢式PCR原理进行扩增，将两个长接头序列设计成内外两对引物，先用外侧那对引物进行PCR反应。 基于PCR抑制效应的存在，只有那些代表了具有差异表达的，且两端同时接有不同接头的双链cDNA片段（e型分子）才能在PCR中得到以指数扩增，而a、d类分子没有引物结合点，b类分子由于两端均为同一接头，在链内极易形成发夹结构，故此3类分子均不能得以扩增，而c类分子一端无接头，只能线性扩增。这样经过两轮PCR使差异表达的基因片段再次得到富集而构建成由差异cDNA片段构成的消减文库。 换言之，e型分子两端都能和引物配对，扩增效率高，而c型的双链分子只在一端有一个引物配对，扩增效率比e型分子低得多，b型分子由于两端有长序列的反向重复，可互补形成牢固的“锅-柄”二级结构，无法进行有效扩增。第二轮PCR再用内侧那对引物进行配对，可极大提高扩增的特异性，使在最后的PCR产物中绝大部分是e型分子。 （4）消减文库的扩增与鉴定：将消减文库中的差异表达的cDNA片段以适当方式（T/A方式或酶切粘性末端互补方式）插入载体，转化细菌，扩增文库后，经x-gal蓝白斑/抗生素初步筛选后，随机挑取白色克隆制备质粒，酶切后分析插入片段。 （5）对克隆出的片段进一步分析鉴定：包括用二次PCR产物制备探针，经点杂交筛选阳性克隆；以插入cDNA片段为探针进行Northern blot鉴定差异表达；cDNA序列测定，序列同源性分析；通过文库筛选或步移技术获取完整的差异表达基因全长。 抑制性消减杂交技术较以往差异基因克隆方法有了重要改进，具有三者无法比拟的优点：（1）高度的特异性，这主要来源于以下三个方面的设计特点：a、使用四碱基识别酶酶切，产生＜600 bp的片段，这样可防止cDNA片段形成复杂结构