数据分析的可变性.doc

数据分析的可变性 流式细胞仪的检测结果以一长串简单的二进制数字记录在计算机的文件中，如何准确、客观地分析这些数字是计算机软件所应具备的基本功能。使用这些软件首先应该提出特定的问题，然后在软件的帮助下解决问题，并以流式细胞术所特有的形式表达出来。 如果我们的问题是：“表达某种蛋白的细胞所占的百分率是多少?”，那么在数据分析时首先应当选定这群特定的细胞，在流式细胞术中称为“设门(gating)”。这个过程也成为流式数据分析中的第一个可变因素。细胞可以根据其特定的前向散射光和侧向散射光特征来设定，设定淋巴细胞最常用的方法即是如此。然而根据散射光特性来设门是非常主观的。因为我们至今仍不十分清楚细胞被激活或浸润组织后，散射光特性的改变模式，同时我们不能像荧光信号一样对散射光信号进行很好的质控。所以目前比较公认的方法是用一个荧光参数辅助一个散射光参数来进行设门，通常情况下，这个荧光参数来自荧光标记的CD45抗体。因为CD45在不同的白细胞亚群、不同的发育成熟阶段的表达量有差异，因此“侧向散射光/CD45”双参数设门方案已被广泛地应用于CD4绝对计数时淋巴细胞群的设定(淋巴细胞的CD45强表达，侧向散射光较低)和白血病患者骨髓标本中原始细胞的界定(原始细胞上CD45弱表达，侧向散射光与淋巴细胞相近)。 数据分析时的第二个可变因素为如何确定阳性细胞和阴性细胞的分界线。通常的做法是用一个阴性标本作为参照，这就要求准确、合理地选择阴性标本。阴性标本可以是未染色细胞，也可以是经同型对照抗体染色的细胞(在实际操作过程中，多选择后者)，因此同型对照的选择是所有可变因素的根源。然而，要找倒非常匹配于实验中所用的每种抗体的同型对照通常不很容易。 此外，如果不同实验室所用的阴性对照不同，则他们所确定的阴性细胞和阳性细胞的分界线也不同，导致所得到的“阳性百分率”结果出现差异。即使所用的阴性对照非常合适，确定阴性/阳性的分界线也是有所不同。有人认为应，该将分界线定在假阳性率(即在阳性细胞区的阴性细胞百分率)为1%～2%处，而有人则认为，应在假阳性率为5%左右处。如果要检测的细胞抗原表达量较高(如CD3和CD4等)，结合的荧光抗体也相应较多。这样阳性细胞的荧光强度会明显高于阴性细胞。此时，采用上述何种分界原则对结果的影响不大。但如果要检测的细胞抗原表达量较少或很少(如CD62p和CD95等)，染色后阳性细胞区会与阴性细胞区部分或大部分重叠，此时分界原则不同，结果会有较大的差异。 事实上，在出现阳性细胞区与阴性细胞区重叠时，尤其对于白血病/淋巴瘤免疫分型，我们应该考虑使用“阳性百分率”来分析结果是否合适，在这种情况下，我们经常会采用寻找表达异常抗原组合和异常抗原量的特殊细胞群，以确定白血病/淋巴瘤的类型，而不关心这些特殊细胞的百分率。因此，将细胞的荧光标记强度与带有标准荧光强度的微球进行比较，在此时显得尤为重要。此外，用流式细胞术进行白血病/淋巴瘤的免疫分型，已经从传统的报告数字结果过渡到基于二维或轮廓图(contourplot)的“模式识别”，即人们不再关注表达某种抗原(如CD19，CD33，CD34等)的细胞百分率为多少，而是更注重通过多参数分析来确定是否存在异常细胞群体。虽然室间质控可以保证不同的实验室对统一标本得到相同的结果。但对于白血病/淋巴瘤的“模式识别”，因任意两个患者的表现形式均有差别，也就不存在衡量正确与否的“金标准”。此时，室内质控则非常重要，即要保证机器处于良好的状态，使用标准化的试剂及客观的分析结果。 数据分析的最终质控步骤在于对数据的检验，即以单参数直方图、点图、轮廓图等多种形式分析比较数据，以确定结果的可靠性。视觉观察图形经常会使我们发现仪器、标本及标本处理过程中存在的某些问题。此外，数字结果有时可用“内部一致性”原则来校验。如在分析CD4时，在保证对淋巴细胞的设门标准(即淋巴细胞回收率gt;95%，淋巴细胞纯度gt;90%)的同时，还要保证CD3+/CD4+细胞与CD3+/CD8+细胞之和约等于CD3+细胞总数，且CD3+细胞(总T细胞)、CD19+细胞(总B细胞)及CD3-/CD(16+56)+细胞(总NK细胞)百分率之和近似于淋巴细胞门中淋巴细胞的纯度。此外，因在CD4表型分析或绝对计数时，在每个抗体反应管中均包含CD3抗体，所以分析比较每个管中的CD3+细胞百分率可以进一步对实验进行“内部一致性”的质控。 大头医生/ KKME---专业医学有哪些信誉好的足球投注网站引擎/