分子生物学与生物化学实验操作设计与技能(7-2).ppt

RT-PCR的实验条件具有个性化 网上的一个例子： 我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。? ? 记得我开始我的ＲＴ－PCR时，按常规方法，提取总ＲＮＡ后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了Ｎ次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断（尽管她用这些ＲＴ－ＰＣＲ产物做模版再进行ＰＣＲ时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了９mers随机引物），用我的引物进行一般PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制。 分子生物学与生物化学实验操作、设计与技能 几种重要的PCR技术(一) 李刚 副教授 几种重要的PCR技术 差异显示PCR 3 RT－PCR； 1 出错PCR（致突变PCR） 4 5‘－RACE和3’－RACE PCR； 2 OE－PCR 5 RT-PCR概述（1） RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。 　　 RT-PCR概述（2） 首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。 常见的三种反转录酶特性 1、鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV）与鼠白血病病毒勒尼株（Mo－MLV）来源的中温酶。AMV来源的反转录酶具有高活性的RNase H,这种高活性RNase H趋向于抑制cDNA的产生限制其合成长度。Mo－MLV来源的反转录酶更适合RT－PCR，因为它的RNase H活性较弱。但它催化反应的最适温度为37度，较AMV反转录酶的42度为低，因而对于具有高度二级结构的RNA模板可能会带来稍微不利的影响。 2、缺乏RNase H活性的Mo－MLV反转录酶的突变体。这些酶较野生型酶对模板RNA分子的转录效率更高，合成cDNA分子的长度更长。此外，还能在更高温度下合成cDNA（高达50度），这对于容易折叠成二级结构的RNA模板更为有利。 3、嗜热热稳定Tth DNA聚合酶，这种酶在RT－PCR中的主要优点：它能在反转录与扩增两个阶段均起作用，实验在同一个反应管内进行。但这种酶功不抵过，一方面这种酶合成的cDNA平均长度仅为1－2kb,它短于Mo－MLV反转录合成的cDNA长度（约10kb）；此外，Mn2＋的存在会造成DNA合成的低保真度也是令人担心的地方。最后，该酶不能用Oligo(dT)或随机六核苷酸作为引物，因为它的催化反应的最适温度下这两种引物不能与RNA模板形成稳定的杂合体。 RT－PCR的用途（Reverse transcriptase-PCR） 反转录PCR是一种从RNA扩增cDNA 拷贝的方法。RT－PCR对于获得克隆mRNA的5‘、3’末端序列和从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库方面都是极为灵敏和通用的方法。此外，RT－PCR还易于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性；还可用于测定基因表达的强度，尤其是在可获得mRNA数量有限和目的基因表达水平很低时即可用RT－PCR方法分析。 RT－PCR的原理 RT-PCR是一种从细胞RNA（mRNA）中高效灵敏地扩增cDNA序列的方法，它由两大步骤组成：一步是反转录（RT），另一步是PCR。反转录的起始材料可以用总RNA，也可以用mRNA。 首先，在反转录酶作用下将RNA（mRNA）反转录成c