分子生物学基本实验操作课件.ppt

HEADLINE 2.3.4 PCR体系的优化 PCR反应条件视模板、引物的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据 模板来源、目的片段的大小及碱基组成、引物性质等的具体情况摸索出最佳 反应条件。 （1）引物退火温度 退火温度是PCR实验的一个重要参数，对PCR的特异性有很大影响。一般根 据所设计引物退火温度上下5℃来进行梯度实验，摸索出适合的退火温度； （2）引物浓度 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM，较高的引 物浓度会导致非特异性产物扩增； 2.3.4 PCR体系的优化 （3）镁离子浓度 ??? 可以从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子浓度梯度实验； （4）循环参数 在PCR的前5-10个循环使用严紧的退火温度，使 特异性产物得到优先扩 增，然后在一个较低的退火温度下反应20-30个循 环；也可以使PCR反应在 一个高的退火温度下开始，然后每个循环降低0.5℃到2℃，直到退火温度低 于引物设计温度5℃； 2.3.4 PCR体系的优化 （5）热启动 冰上配制PCR反应液，将其置于预热的PCR仪上开始反应；另外还可利用具 有 热启动功能的DNA聚合酶来实现热启动； （6）巢式PCR 对于一些较难扩增的模板，可以进行巢式PCR扩增，以提高特异性和灵敏度。 第一轮是15到20个循环的标准扩增，将扩增所得产物稀释100到1000倍做为模板， 利用巢式引物进行15到25个循环的第二轮扩增。 2.3.4 PCR体系的优化 （7）其他 对某些结构较为复杂的模板，包括高GC含量的模板，需要添加一些促进剂以获 得特异性的PCR产物，如甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等可以增强PCR的扩增。 为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，一般添加剂的浓度为甘油5%-10％，甲酰 胺1%-5%或者DMSO 2%-10%。 此外有市场化的GC rich 的buffer，效果不错 一般都采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，初步判断产物的特异性。PCR产 物片段的大小应与预计的一致，最终结果的确定还需要测序验证。如果产物特异性 好，5微升检测能看见清晰的带，可以直接将产物送测序，否则必须割胶回收。 2.3.5 PCR产物分析 （1）PCR所需要的试剂均应在紫外灭菌后的超净工作台或负压工作台配制和分装； （2）不能混用PCR产物分析室的吸头，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶 胶的污染； （3）在打开PCR反应管时应避免产物飞溅，如果溅到手套或桌面上，应立即更换 手套，并用稀酸擦拭桌面； 2.3.6 PCR实验操作注意事项 PCR的污染非常可怕，较难消除，尤其是在进行大量PCR实验的时候更容易发 生污染，在实验操作的时候要严格注意以下几点： （4）PCR反应较多时，可以将相同组分制备反应混合液，然后分装，这样 既可以避免污染，又可以增加反应的精确度； （5）必须设立阴性对照，尤其是在进行菌落或者菌液PCR验证的时候，如 有可能，应该也同时建立一个阳性对照，这样可以验证PCR反应的可 靠性； 2.3.6 PCR实验操作注意事项 （6）移液器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用高压处理的加样 器，如果不能高温高压处理，至少PCR操作过程中的移液器应该专用，尤其 是PCR产物分析所用的移液器不能拿到标本处理区和PCR扩增区； （7）在优化实验条件之前，应该注意所剩的PCR试剂是否足够完成后续的实验， 尤其是反应buffer和酶，不能在优化好条件之后更换试剂，这样很可能需重新 摸索条件。 2.3.6 PCR实验操作注意事项 3 克隆 3.1 原理 普通DNA聚合酶具有末端转移酶的活性，通常能在PCR产物的3‘端加上A尾 单核苷酸，从而实现PCR片断与一个具有3‘-T突出末端的载体连接； 限制性内切酶可识别DNA序列的特定位点并切割DNA产生粘性末端，酶切 后的DNA片段经纯化处理后可以与具有相同粘性末端的载体相连接。连接产物 转化感受态细胞，铺板培养，筛选阳性克隆。 3.2 克隆步骤 3.2.1 载体和目的片段的酶切 （ 1）限制性内切酶反应在灭菌的PCR管中进行，20μl体积反应体系如下： DNA