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液相色谱基础知识 色谱柱基础知识 对HPLC柱填料的了解 平均颗粒度，颗粒度分布 颗粒度(dp) 颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差) 颗粒分布 颗粒分布越宽∶柱效低(渗透性差) 颗粒形状 球型∶柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型：柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展 对HPLC柱填料的了解（二） 平均孔径/孔体积 孔径/孔体积分布 大的孔径可分析高分子量的分子 对HPLC柱填料的了解（三） 键合相化学 影响化合物的分离度：a 不同键合相对不同种类的化合物分离不同 可能导致色谱的分离机理不同 如：C18、C8、CN 硅胶表面及键合相 键合相色谱柱 以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。 优点∶ 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点∶ pH值不能小于3 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同 对HPLC柱填料的了解（四） 含碳量 含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加） 高含碳量 有利于不易保留的化合物的分离 水解稳定性好，重现性好 有利于极性化合物的拖尾改善 低含碳量 有利于分析中性及碱性化合物 降低溶剂损耗 不同色谱柱的含碳量 色谱柱 C% k苊 (50/50的乙腈/水) Symmetry C18 19 17 Zorbax ODS 17 15.7 LiChrosorb RP-18 15 10.3 Symmetry C8 12 12.5 Resolve C-18 12 12.4 Ultrasphere ODS 11 11.3 Partisil ODS-3 11 12.0 mBondpak C-18 10 7.9 Nova-Pak C-18 7 5.5 对HPLC柱填料的了解(五) 填料的端基封口 封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%） 残基处理的效果 对HPLC柱填料的了解（六） 硅胶的活性 主要影响碱性化合物的保留行为：k 生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 是选择性差异的主要来源 硅胶的杂质含量 重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 是色谱柱质量好坏的重要标志 对HPLC柱填料的了解（七） 填料的稳定性 硅胶填料 pH：2-8 聚合物填料 pH：2-12 pH值小于2时键合相水解 填料基质物理性质的影响 所有C18柱都是相同的吗? 填料基质的物理性质对色谱柱的影响 平均孔径及其分布∶影响被分析样品的分子量，大孔径的可分析高分子量样品 平均孔体积及其分布∶影响同孔径 含碳量∶影响化合物的保留时间，高含碳量保留时间长 填料的端基封口∶主要影响碱性化合物的峰形，未封口会使碱性化合物拖尾 硅胶的活性∶主要影响碱性化合物的保留行为：K’，高活性的K’大 硅胶的杂质含量∶更苛刻条件下的碱性化合物峰形 Waters色谱柱的内径 分析柱：Waters Spherisorb及其它公司品牌的色谱柱多为4.6mm内径。Waters传统品牌的分析柱以3.9mm内径为主，比一般分析柱(4.6mm)细，因此： 相对灵敏度高 省溶剂，可用相对较低的流速 同样的流速下，柱压较高(高效柱尤为明显) 注意在用文献方法时转换流速,即:降低流速,以保持线速度相同。 色谱柱化学及外形结构的关系 对HPLC柱的了解 理论塔板数(N),容量因子(K’),选择性系数(?),其影响因素有∶ N：受平均颗粒度及颗粒度分布的影响,颗 粒度越小,N越高 ?：受填料表面化学性质对色谱柱的影响, 不同键合相对不同种类样品分离不同 K’：受键合相表面含碳量的影响,含碳量高 时保留时间长 在同样情况下保留行为也有差异 因此： 需要对色谱化学品(色谱柱)有更多的了解 需要不同品牌，即各个因素有较大差异的色谱柱，以得到更多种选择性 Waters拥有众多不同品牌的色谱柱，目的就是：供不同应用的要求 用不同品牌的色谱柱时，色谱方法有时可能需要重新开发 Waters各种硅胶基质的色谱柱 Waters不同品牌的色谱柱 m-BondaPak 文献背景强, 是工业标准 平均孔径125?，10mm高活性、无定形硅胶 中等疏水性表面，端基封口。有独特选择性 Nova-Pak 平均孔径60?，4mm高韧度低活性球形硅胶 低酸性，高疏水性, 极好的端基封口 有利于小分子物质的分析 Waters不同品牌的色谱柱 Resolve 平均孔径90?，5/10 mm低活性硅胶 非常高的疏水性, 无端基封口 有利于低保留的中性及酸性化合物分离 Delta-Pak 有100?和3