原核诱导表达课件.doc

原核诱导表达的标准操作程序（SOP） 一．目的： 使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。 二．适用范围： 本SOP适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。 三．实验原理： E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 四、试剂准备: （一）实验器材的灭菌： 枪头的灭菌： 1mL，200μL，20μL的枪头放入枪头盒，用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常温放置。 螺口管及离心管的灭菌： 将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中（盖子要拧松，离心管的管盖打开），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常温放置。 50mL离心管的灭菌： 将50mL离心管用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常温放置。 （二）LB培养基的配制 液体LB培养基（1L）：蛋白胨 10g 氯化钠 10g 酵母提取物 5g 调PH值到7.5，高压灭菌，4℃保存。 固体LB培养基（1L）：蛋白胨 10g 氯化钠 10g 酵母提取物 5g 琼脂粉 15g 高压灭菌，不烫手的情况下加入抗性，抗性：培养基=1：1000（氨苄，卡那通常浓度），混匀。马上在无菌操作台中倒平板，并开大风吹干。用封口膜封住，倒置放于4℃保存。 （三）1M IPTG的配制： 经过计算，10g IPTG可以配42ml的1M IPTG。买来的粉末状的IPTG一般全部配成1M IPTG。 1、无菌操作台紫外线照射，后通风。 2、用少量去离子水将IPTG溶解完全，并定容。 3、在无菌操作台中，用0.22μm的滤器将配好的IPTG滤入灭菌后的1.5ml离心管中，过滤除菌，-20℃保存。 注意事项：在用滤器将IPTG滤入离心管时，先用针头吸IPTG，然后将枪头拔掉，排出气体，滤头加入IPTG液，在使针管与滤器相连，保证整个装置无气体进入。滤的过程中，手不能碰滤头。 （四）3×SDSloading buffer的配制： 3×SDSloading buffer 10ml 1M Tris-Hcl (PH 6.8) 1.5ml SDS 0.6g BPB(溴酚蓝) 30mg 甘油（丙三醇） 3ml 去离子水 5.5ml 1．将除BPB以外的药品完全溶解。SDS常温下很难溶解，可以在37℃水浴溶解。完全溶解后，再加入BPB，进行溶解。 2．把溶好的buffer分装到1.5ml的离心管中，1ml/管，常温放置。 3．使用前，每管加入30μL巯基乙醇。 注意事项：巯基乙醇为危险品，加入的过程在通风橱中完成，并且带好手套。 （五）10×PBS的配制： 0.1M PBS（10×PBS） 1L NaH2PO4.2H2O 2.83g Nacl 85g Na2HPO4.12H2O 28.98g 用去离子水将以上药品进行溶解。（溶解的非常慢，可能需要过夜） 调PH值到7.2，用0.4μm的滤膜过滤。常温保存。 工作时用的是1×PBS。 （六）1.5M Tris-Hcl (PH 8.8) 的配制： 1.5M Tris-Hcl 250ml Tris 45.425g 用200ml去离子水将Tris溶解。 2．用浓盐酸调PH值到8.8。 3．调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。 4．0.4μm的滤膜过滤，常温保存。 注意事项：Tris的缓冲能力很