双向电泳技术流程课件.ppt

双向电泳的技术流程 第一部分 样品制备 蛋白定量 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。 变性剂 通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。常用尿素和CHAPS联合，但所得的样品容易吸附在IPG胶条的基质中而丢失。硫脲的作用更强，但溶解度相对较差，常用2M硫脲＋5~7M尿素混合使用。 样品制备 特殊样品的制备 低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级＋窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。 高不溶性蛋白的分离：主要还是要增加蛋白质的溶解度，采用顺序抽提法进行。 主要是应用超速离心技术和顺序抽提法将总蛋白质组分成不同的蛋白质组亚群，再用适当的蛋白溶解液溶解，以降低样品的复杂性、提高分辨率。常用方法为： 1、用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解，这不仅大大减少样品的复杂性，而且展示出的蛋白质可确定其亚细胞定位。该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。 2、根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行顺序抽提，从而分离出具有不同溶解度范围的蛋白质组亚群。 一般分3个层次： 第一步用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白； 第二步是把未溶解的小片（pellet）用常规IEF样品液（8Ｍ尿素＋4%CHAPS＋DTT）溶解，这次抽提剩下的小片主要是富集的膜蛋白，约占整个样品的11%（W/W）； 第三步是用增强的蛋白溶解液5M尿素＋2M硫脲＋2%CHAPS＋2%SB3-10＋2MTBP作最后的抽提。 碱性蛋白：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3－12、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。 极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在常规Tris/甘氨酸缓冲液中，样品和缓冲液中游离的SDS离子将持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。 样品制备 样品的纯化 蛋白样品的纯化 样品进行纯化的试剂盒 ReadyPrep 2D Clean-up Kit:去除盐分及其他杂质 ReadyPrep Reduction-Alkylation Kit:显著提高碱性蛋白分辨率 DNA/RNA等可以同蛋白质形成超大分子量的复合物，从而影响蛋白质的电泳分离。 一般在用40mM Tris溶液裂解细胞时，加入DNA消化酶，即可有效去除DNA。 量：1ml溶解液中加入150~300U的内切核酸酶，室温反应20min即可。 蛋白样品的处理试剂盒 总蛋白提取 ReadyPrep Protein Extraction Kit (Total Protein) 分步提取蛋白,能得到更多的蛋白 ReadyPrep Sequence Extraction Kit 膜蛋白提取 ReadyPrep Extraction Kit (Membrane I) ReadyPrep Extraction Kit (Membrane II) 信号转导蛋白的提取 ReadyPrep Extraction Kit (Signal) 定位在细胞核或细胞浆中的蛋白 ReadyPrep Extraction Kit(Cytoplasmic/Nuclear) ReadyPrep 2-D试剂盒 蛋白的定量 采用比较蛋白质组学方法进行研究，有一个重要的前提是要保证各实验组间的实验条件的一致。因此在实验前应对蛋白进行定量，以保证蛋白上样量一致。考虑到在定量的同时蛋白的降解也在进行，因此需要采用一种快速和相对准确的蛋白定量方法。 用于蛋白的快速定量方法主要有A280法、Bradford法、Lowry 法三种方法，其中A280法灵敏度为0.2-2 mg/ml，但核酸可引起强干扰作用；Lo