狂犬病免疫球蛋白效价测定.ppt

四、中和实验技术 抗体效价计算： 四、中和实验技术 四、中和实验技术 四、中和实验技术 五 中和实验的影响因素： 病毒的中和反应是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因数有病毒、抗血清、宿主细胞和实验操作误差等诸多因数，这些因数都会影响中和实验的规律。 五 中和实验的影响因素： 1、病毒：在敏感动物能稳定传代培养的病毒株，制成新鲜的病毒悬液，实验前，经感染滴度（LD50）测定，因为动物存在个体差异，所以每一次中和实验时病毒的感染滴度（LD50）不一样。 五 中和实验的影响因素： 2、血清：用于中和实验的病毒特异性抗血清（免疫血清），阴性对照血清（与制备免疫血清同种动物的正常血清）及被检血清。均必须保持无菌，一般使用前需加热灭活，冷却后用于实验，不能反复冻溶使用。 五 中和实验的影响因素： 3、孵育温度和时间：病毒与抗血清混合，0℃情况下，不发生中和反应，5℃以上中和反映即可发生，常规采用37℃水浴1小时，一般病毒可发生充分中和反映，但针对不同耐热的病毒，孵育温度和时间应有所增减。 五 中和实验的影响因素： 4 实验动物的选择：实验动物的质量，可直接影响中和实验的结果。狂免效价测定用小鼠质量为10-12g。 六 实验操作过程的体会 1、病毒制备：取小鼠脑组织时将小鼠血先放掉后取得的脑组织不带血，这样不会影响所得病毒悬液浓度。取每只小鼠脑组织都要换新的剪刀，以保证无菌操作。研磨时加少量小牛血清缓冲液把脑组织研磨融烂后再加所需缓冲液至需要量。研磨时间尽量快。离心时应在2℃离心悬液。 六 实验操作过程的体会 2、稀释病毒和样品时应吹打10次以上，吹打时尽量不可产生气泡，每个稀释度的吹打次数、力度、高度应一致，这样可保证稀释质量。 六 实验操作过程的体会 3、孵育时一定保证水浴温度和时间，水应埋过样液，到30分钟时拿出水浴用手震荡一次，使其中和均匀。 六 实验操作过程的体会 4、注射攻击时速度尽量快，应其注射量小，注射器取样时手法要快，排尽气泡。进针2-3mm，看脑内注射量时眼与注射器尽量平行。拿准攻击部位，从脑内退针时用大拇指和食指捏一下注射部位，以防止小鼠颅内压高而使注射液量外溢。 六 实验操作过程的体会 5、实验观察过程中注意小鼠的饮食情况、温度、湿度，勤换垫料，因氨浓度对小鼠质量有一定的影响。勤捡死亡和发病小鼠，防止其他小鼠对其撕咬等交叉感染。以达到最理想的实验结果。 六 实验操作过程的体会 6、攻击注射时一定记住样品和标准从浓稀释度往稀稀释度注射，病毒对照回滴从稀稀释度往浓稀释度注射。最好是每个稀释度换一支注射器。 六 实验操作过程的体会 7、因实验小鼠质量存在个体差异，中和用病毒悬液经孵育后病毒量要求在32～320LD50之间，中检所作100 LD50，我在做病毒回滴时做150 LD50。 小 结 为了保证动物实验的质量，防止实验动物之间发生交叉感染以及避免实验人员实验室感染，我在今后实验中要以严谨的工作态度、科学的工作作风，在实践中不断的学习、总结和积累经验。 小 结 希望通过这次特免质量研讨会，我会向山东泰邦公司和西安回天公司的老师虚心学习和交流，把实验做好。 谢谢！ 狂犬病免疫球蛋白效价测定（小鼠法） 贵州泰邦生物制品有限公司 质量管理部：姜志文 实验步骤 一、狂犬病毒的传代 二、狂犬病毒CVS的制备 三、病毒的保存 四、中和实验技术 五、中和实验的影响因素 六、实验体会 一、狂犬病毒的传代 从中检所购买冻干CVS毒株后，取其制成10-2悬液，脑内攻击小鼠0.03ml/只，每只小鼠10～12g，待发病后取脑再制成10-2悬液，攻击小鼠脑内进行传代，传至2～3代后选用第5天发病并麻痹的小鼠取脑制成-70℃冻存的中和用毒种。 二、狂犬病毒CVS的制备 启开毒种，稀释成10-2悬液，接种10～12g小鼠0.03ml/只，不少于10只，每只脑内攻击传代，选择攻击4～5天有典型狂犬病症状的小鼠脑组织，研磨后加入2%或20%小牛血清PBS制成悬液（每只鼠脑加3ml），经2000转离心沉淀20分钟后，取上清液经病毒制成10-1滴定毒力和无菌检查符合规定后分装0.5ml/支作攻击病毒用。 1、小鼠脑组织的获取 ⑴ 取鼠脑前的准备： a 先用自来水多次冲洗小鼠，去掉身上脏物。用新洁尔灭消毒液浸泡换洗小鼠，3—5分钟。 b 操作用(解剖钳、手术刀、剪刀、镊子、平皿)，用蒸馏水煮开10—15分钟后将水到掉，经高压后用。  （2）取脑步骤： a 将小鼠放在平皿上，一手用镊子固定小鼠，一手拿剪子从颅部到咀部的皮肤完全切开，同时去掉耳朵和上眼睑。 b 左手用镊子固定住小鼠的咀部并用手术剪开脑腔，首先切开从眼窝到中线，自颅顶骨