富硒金针菇硒蛋白清除羟自由基探究.doc

富硒金针菇硒蛋白清除羟自由基的研究 　　摘要 探讨甲基紫-Fe2+-H2O2体系的实验条件，得到了最佳的测定方案：pH值=3.5，甲基紫浓度1.4×10-5 mol/L，Fe2+浓度1.2×10-4 mol/L，H2O2浓度0.12%。在最佳实验条件下，采用紫外可见分光光度法研究了富 羟自由基是氧化能力极强的自由基，能很容易地氧化各种有机物和无机物。它可以与活细胞中任何分子（包括糖类、有机酸、核苷等）发生反应造成损害[1]。为了降低这种损伤，可选择一些抗氧化效果的食品食用，或者使用抗氧化剂[2]。硒是一种微量元素，对人体的正常代谢是不可缺少的。它可以有效地对体内的自由基起到清除效果，又可以起到抗衰老的作用[3-5]。硒能与包括多糖、蛋白、核酸等在内的物质结合，形成含硒多糖、含硒蛋白、含硒核酸等，构成了生物体内主要的含硒生物大分子物质[6]。笔者利用甲基紫-Fe2+-H2O2体系研究了富硒金针菇中硒蛋白对羟自由基的清除作用 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 HZQ-Q全温震荡器；冷冻离心机；7500c型ICP-MS；Cary 50紫外―可见分光光度计；考马斯亮蓝G250；硫酸铵；甲基紫溶液（2×10-3 mol/L）；过氧化氢溶液（0.12%）；Fe2+溶液（1×10-3 mol/L）；缓冲溶液Tris-HCl：pH值3.5～7.5 1.2 试验方法 1.2.1 富硒金针菇硒蛋白的制备。称富硒金针菇干样1.0 g，加20 mL二次水，在全温振荡器搅拌提取2.0 h，抽滤至干。重复1次，合并滤液。根据结合溶液的体积准确量取一定体积的硫酸铵，要一边搅拌，一边慢慢向烧杯内部加入，直到硫酸铵的饱和度达到95%，经过透析后，进行硒含量C硒以及蛋白浓度C蛋白的测定，方法分别选择ICP-MS法和考马斯亮蓝染色法 1.2.2 羟自由基的测定。在比色管（10 mL）中分别加入浓度为2×10-4 mol/L的甲基紫溶液1.4 mL、浓度为0.1 mol/L的pH值为3.5的Tris-HCl 0.1 mL、浓度为1×10-3 mol/L的Fe2+溶液1.2 mL，浓度为0.12%的H2O2溶液1 mL，最终体积定容到10.0 mL，不足部分用离子水补足，并混合均匀。放置30 min后，在波长578 nm处测定吸光度，计算其与空白参比？驻A。空白将Fe2+溶液和H2O2换成H2O即可 1.2.3 富硒金针菇硒蛋白对羟自由基的清除率计算。在1.2.2体系中，加入一定量的硒蛋白提取物，低浓度组、中浓度组、高浓度组分别加硒蛋白1.0、3.0、5.0 mL，充分混合均匀后再加入H2O2，静置30 min后再对溶液的吸光度进行测定，计算出硒蛋白清除率S，公式如下： S（%）=[（A样品-A空白）/（A对照-A空白）]×100（1） 2 结果与分析 2.1 试验条件的优化 2.1.1 吸收光谱。分别测定了甲基紫溶液（MV）、MV-Fe2+溶液、MV-H2O2溶液和MV-Fe2+-H2O2溶液的吸收光谱，发现前三者的最大吸收波长均在582 nm附近且吸光度值几乎不变，而MV-Fe2+-H2O2溶液的最大吸收波长移到578 nm，并且吸光度明显降低，说明体系吸光度值的下降是Fenton试剂产生的羟自由基与甲基紫作用的结果 2.1.2 缓冲液的影响。考察了缓冲液pH值和用量对？驻A的影响。随着体系酸度的降低，？驻A降低，在pH值=3.5时体系？驻A最大，故选择体系的酸度为pH值=3.5。？驻A随着缓冲液用量的增加在降低，但在0.75、1.50 mL之间变化非常缓慢。故本实验选用缓冲溶液体积为1.00 mL 2.1.3 甲基紫用量的影响。缓冲溶液pH值为3.5，用量为1.0 mL，加入不同体积的甲基紫溶液，随着甲基紫用量的增加，？驻A也在增加。当甲基紫溶液体积为3.5 mL时，？驻A趋于稳定。所以本试验甲基紫用量为3.5 mL 2.1.4 Fe2+用量的影响。在缓冲溶液pH值为3.5，用量为1.0 mL，甲基紫用量为3.5 mL的条件下，考查Fe2+用量对？驻A的影响。随着Fe2+溶液用量的增加而增加，当Fe2+用量为3.0 mL时，？驻A趋于稳定，故本实验Fe2+用量为3.0 mL 2.2 富硒金针菇硒蛋白清除羟自由基作用 经考马斯亮蓝法和ICP-MS法测定，金针菇硒蛋白C硒为0.98 μg/g，C蛋白为95.83 μg/mL。根据羟自由基工作原理，进行反应体系的设计，分别加入C蛋白空白蛋白1 mL（低浓度组）、C硒Se的亚硒酸钠溶液3 mL（中浓度组）、硒含量C硒的富硒金针菇硒蛋白5 mL（高浓度组），保证硒和蛋白质的浓度保持在一个水平 中可以看出，加入亚硒酸钠、蛋白和硒蛋白后