扁平疣患者HPV型别、性激素水平、人体免疫状况探讨.docVIP

扁平疣患者的HPV型别、性激素水平、人体免疫状况探讨 　　【摘要】 目的：检测扁平疣患者感染HPV的类型、外周血中免疫活性细胞（CD4+、CD8+、Th17细胞）及性激素（雌二醇、孕酮、睾酮、泌乳素）的表达水平，探讨其在扁平疣发病机制中的作用。方法：选择2012年3-8月于笔者所在医院皮肤科门诊就诊的扁平疣女患者30例为研究对象，设为扁平疣组，同期选取与扁平疣组年龄相当的30例健康成年女性为正常对照组。用PCR与RT-PCR方法检测扁平疣组患者病损表皮中HPV的类型；采用放射免疫分析法检测两组受试者血清雌二醇、孕酮、睾酮、泌乳素的表达水平；用流式细胞术检测外周血的免疫活性细胞（CD4+、CD8+、Th17细胞）水平，观察比较两组检测结果。结果：扁平疣患者HPV型别以HPV2最为常见，感染率为28%，其他依次为HPV3、HPV10、HPV1。两组间性激素水平比较差异无统计学意义（P0.05）。扁平疣患者外周血CD4+、CD8+、Th17 T淋巴细胞亚群均较正常人下降，两组比较差异均有统计学意义（P0.05）.Peripheral blood CD4+，CD8+，Th17 T lymphocyte subsets in patients with flat wart were decreased compared with normal persons，the difference was statistically significant between the two groups（P 　　1 资料与方法 1.1 病例入选标准 参照赵辩主编的《中国临床皮肤病学》第三版扁平疣诊断标准，皮损为米粒到绿豆大小扁平隆起的丘疹，表面光滑质硬，孤立散在，淡褐色或正常肤色，多发于暴露部位（面部、手背），可见同形反应，部分患者伴有微痒[6]。选择2012年 3-8月于笔者所在医院皮肤科门诊就诊的扁平疣患者30例为研究对象，设为扁平疣组。所选患者均为女性，年龄23～44岁，平均（31.34±11.47）岁，病程1～178周，平均（29.94±20.29）周。仅累及面部者18例，面部与手背并发者12例；病情分型：相对稳定型6例，相对活跃型15例，反应型5例，消退型4例。同期选取与扁平疣组年龄相当的30例健康成年女性为正常对照组，两组受试者一般资料比较差异均无统计学意义（P0.05），具有可比性。在所有患者知情同意后，每例选取合适的病灶，刀片削取少量皮屑置于无菌EP管内，-80 ℃冰箱冷冻保存；同时在月经第2～3 d空腹抽取静脉血10 ml，离心后取血清保存在-20 ℃冰箱待检。正常对照组用同样的方法提取相应样本保存待测 1.2 疣体标本基因组DNA的抽提 采用AxyPrep基因组DNA小量制备试剂盒，按照说明书提取样本DNA，用于PCR扩增 1.2.1 HPV引物设计及PCR反应 HPV通用型引物1∶MY09/11，是一组针对嗜黏膜性HPV所设计的通用引物，用于扩增组织HPVL1片段的高保守区；HPV通用型引物2∶CP65/70，是针对EV型HPV所设计的通用引物；PC03/05用于扩增人β-珠蛋白基因，以验证DNA模板质量，并排除PCR反应体系中抑制因子的影响。反应采用50 ?l体系，采用的酶系统为Promega公司的GoTaq? Master Mixes，按说明书加水和引物及DNA模板量。PCR仪为Hema 480型基因扩增仪。每次PCR反应均设不加DNA模板的同体积水的空白阴性对照。扩增产物分别取5 ?l进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察判断结果并用凝胶成像系统照相 1.2.2 测序 取凝胶成像系统上有阳性条带（大约450 bp）的PCR扩增产物送测序公司SAP纯化处理，进行正反向双向测序，人工校对测序图，对正反两向测序序列进行拼接后在Genebank的blast上比对，判定HPV型别。部分标本同时作两对通用引物MY09/11和CP65/70扩增，其产物同时正反向测序以分析测序结果的一致性 1.2.3 型特异性引物（TSP）PCR验证测序结果的特异性 根据测序的结果所示的HPV型别，对标本DNA进行6对型特异性引物PCR，分别为TSP2、TSP4、TSP6、TSP11、TSP16、TSP18，以上型特异性引物引物序列和PCR产物大小及PCR反应条件见表1、表2、表3。上诉引物均参照文献设计，由南京凯基生物工程技术服务有限公司合成[7-9] 1.3 性激素水平的检测 采用放射免疫分析法，按天津九鼎生物技术公司生产的125碘放射免疫试剂盒说明书进行操作，检测样本中血清雌二醇、孕酮、睾酮、泌乳素的表达水平 1.4 外周血细胞免疫状态的检测 使用流式细胞术检测所取外周血样本中的免疫