人肿瘤细胞非显带染色体制备-张.ppt

人体肿瘤细胞非显带染色体的制备 实验目的 熟悉：人肿瘤细胞染色体制备的基本原理和操作方法。 肿瘤细胞染色体数目和结构的异常。 实验原理 目前大多数癌症都建立了相应的细胞株或细胞系，体外培养的肿瘤细胞多属于连续分裂的周期性细胞。收集生长旺盛的肿瘤细胞，加入有丝分裂阻滞剂秋水仙素预处理4-6 h，再经过低渗、固定、染色等过程，就可获得肿瘤细胞非显带染色体。 实验材料和用品 1．细胞株 人肿瘤细胞（7721、Hela等） 2．器材和仪器 光学显微镜、超净工作台，CO2培养箱、培养瓶、离心机、冰箱、镊子、记号笔 实验材料和用品 3、试剂 1640培养基、双抗（链霉素、青霉素）、小牛血清、0.25%胰酶、秋水仙素、0.075mol/L KCl、PBS缓冲液、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、香柏油、擦镜纸、镜头清洗剂 肿瘤细胞培养1-2天(70%~80%丰度） 秋水仙素处理3h(终浓度为1ug/ml ） 低渗（加 KCl 6ml ，37℃水浴40min） 先预固定2min，在固定2次（每次30min） 制片并染色（吉姆萨染液染色20-30min ） 实验流程 镜检（观察并计数） 实验步骤 1. 1. 细胞培养：将生长良好的人肿瘤细胞（7721、Hela等）铺入35mm细胞培养瓶中，加入5ml1640培养基（含10%小牛血清、双抗）后放置于CO2培养箱中培养约2~3天。 实验步骤 2. 终止细胞分裂：细胞生长至70~80%丰度时，加入100ug/ml秋水仙素2-3滴（终浓度为1ug/ml ），轻轻将液体摇匀，继续培养3h。 3.收获细胞：摇匀培养液，移入10ml离心管，1000r/min离心3分钟，弃去上清，保留底部约1ml。 实验步骤 4.低渗处理：加入约 5ml 0.075mol/L KCl溶液 （预先37℃水浴），轻轻打匀， 37℃水浴15min。 5.固定：①预固定：加固定液（甲醛：冰醋酸=3:1）2ml ，轻轻打匀，预固定2min， 1000r/min离心5min，弃去上清，保留底部约1ml。②固定：加入固定液至8ml，打匀，固定30min， 1000r/min离心5min弃去上清，保留底部约1ml。再重复固定1次。 实验步骤 5.滴片：加至1ml固定液制成细胞悬液，滴1~2滴细胞悬液悬空15~20cm至冰水中取出的载玻片上，迅速过酒精灯火焰烤干。 6.染色：在标本片上加数滴吉姆萨染液，染色20min，水洗。 7.镜检：选择3~5个染色体分散好、没有重叠、团聚性较好的细胞，在油镜下仔细观察、计数 。 注意事项： 1. 秋水仙素作用浓度与时间：秋水仙素的作用是抑制纺锤丝和使染色体变短，一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系，如果处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多，但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊，不容易观察。 注意事项： 2.滴片的高度：高度过高, 染色体分散范围过大, 甚至造成染色体丢失;高度过低, 则染色体分散不良。 3.低渗 低渗的目的是让水分进入细胞, 使细胞肿胀、染色体松散, 是染色体制备过程中的关键环节之一。 实验结果 实验报告： 在油镜下观察3个中期细胞，计数染色体数目、结构及异常，试分析人类肿瘤细胞染色体核型？