生物样本冷冻储存技术.docVIP

生物样本冷冻储存技术 　　1 储存温度 　　生物样本的长期储存通常使用尽可能低的温度来降低样本内的生化反应提高样本内各种成分的稳定性。生物大分子、细胞、组织和器官的常用储存温度有-800C(超低温冰箱), -1400C(液氮气相或深冷冰箱)以及-1960C(液氮液相)，温度越低样本的稳定保存时间越长。0～-600C是水的结晶温度，容易对细胞和组织的微观结构造成伤害，一般不使用这一温度来保存组织和细胞。部分经过提纯的生物大分子可以在0～-600C稳定保存一定时间，但在组织样本内生物大分子受到细胞组织内多种因素的影响，稳定性有可能明显降低，所以通常样本库不使用0～-600C作为储存温度。 　　-800C样本储存 　　-800C低于危害性较大的水的结晶温度范围，也是常用设备超低温冰箱能达到的温度，基于操作简便性、储存量和成本等因素来考量，这一温度也是目前保存样本中生物大分子活性的常用温度。但对不同的生物大分子活性这一温度下能保持多久仍无定论。组织中DNA的稳定性可以在-800C下可以保持数年或更长时间。但对RNA来说，则容易被广泛分布于细胞和各种组织里的RNA酶逐渐降解，在不同的细胞和组织中，RNA稳定储存的时间长短也有较大的区别，但一般不超过5年，在一些敏感实验内，RNA在-800C下不到一年就发生了测得出的降解，所以为长期保存RNA活性，建议使用更低的温度，或者利用小部分样本提取RNA与剩余样本同步储存。其他样本内的蛋白质和脂类等生物大分子在样本内在-800C下也能保存，但时间长短不一，稳定性逐渐衰减。如果为保护样本里已知的特定生物大分子，也可加入该分子的稳定剂。如果样本里要保存的生物大分子未定，建议使用更低的温度储存。另外目前常见的大型自动化样本存取设备只能和-800C超低温设备配套使用，尚不能够和液氮设备配套使用。英国的UK Biobank则是把一部分样本的拷贝(～950万)储存在-800C做工作样本，使用自动化设备存;另一部分拷贝(～550万)在另外一个地方储存在液氮气相中做安全备份，样本手动存取。 　　-1400C样本储存 　　-1400C是低于水的玻璃化温度(～-1360C)，也是液氮气相和深冷冰箱能够达到的温度，样本在这一温度范围内其生物学活动极大降低，是保存样本中细胞活性的理想温度。和冰水混合物能维持在00C的相变温度类似，绝缘的液氮容器内液相和气相氮应该维持在相变温度-1960C。但实际上由于液氮容器盖子不够密封，从而导致在液氮液面和液氮容器罐口之间形成一个温度梯度。美国国家癌症研究所建议液氮容器口处的温度应保持在-1400C以下，未来用途未确定的样本应以液氮气相模式储存，以保护组织内细胞活性。 　　深冷冰箱是电制冷，无需液氮，装满样品后的稳定温度通常在-140以下，和使用液氮气相相比，其优势在于不需频繁添加液氮，维护方便。但电制冷的降温速度低于液氮，一旦开启容器取放样品时容易造成较大范围的温度波动，温度恢复时间也相对较长，因而更适合较少开启取放样品的情况。另外电制冷冰箱必须保障供电。在断电情况下推荐使用液氮设备以提供备份储存。 　　-1960C样本储存 　　-1960C是液氮挥发的温度，因而只有液氮液相保存技术能达到此温度。样本内的生命活动在此温度下基本停止，样本的稳定性可以得到长期的保存。是长期保存样本内细胞活性、组织器官的复杂结构及活性的最有效方法，得到广泛认可。与其它不同温度冷冻模式相比，液氮容器液相储存样品需要进一步防护样品间交叉污染。美国国家癌症研究所推荐使用带螺旋的冻存管封装样本。但在降温过程中样品从超低温冰箱(-800C)转移到液氮中时骤然降温，引起冻存管帽和管身收缩不一致，容易导致液氮渗入冻存管从而增加了样品间交叉污染的风险。解决的办法之一是可以使用专门的冻存管套对每个冻存管进行热缩密封，或是使用密封膜在冻存管帽与管身接口处缠2-3圈再储存。前一种方法会使管身加长而需要较高的冻存盒，第二种办法会使管身略变粗，推荐使用底部间隔的10x10规格的常规冻存盒。 　　2 冷冻技术 　　上世纪50-70年代Basil Luyet，James Lovelock，Peter Mazur等学者针对冷冻对细胞和组织的影响展开深入研究，发现损伤主要来源于冰晶损伤和溶液渗透压损伤。随着温度的下降，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞壁破坏，从而导致细胞死亡。这种因细胞内部结冰而引起的细胞损伤即冰晶损伤(Intracellular ice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。同时随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生脱水渗漏，