原生质体融合.ppt

植物体细胞杂交的几个重要进展 1960年 Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功； 1971年 Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株； 1972年 Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物体细胞杂种； 1974年 Kao将聚乙二醇（PEG）诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术； 1978年 Melchers获得第一个属间体细胞杂种（番茄＋马铃薯）； 1981年 Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念； 1987年 Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。 实际操作：先把待融合的细胞或原生质体混合，取样置于100V/cm的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形成项链状排列； 再用1~5V/cm直流电脉冲/微秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的形成。 PEG融合所需试剂 融合液：pH 5.6 CaCl2 2H2O 8~10mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.5~1.0mol 诱导液：融合液＋PEG 20～45％ 稀释液： A液（g/100ml）pH6.0 B液 (g/100ml) pH10.5 葡萄糖 7.21 甘氨酸 0.375 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169 （5）生物诱导融合法——仙台病毒法 仙台病毒是一类被膜病毒，属于附黏液病毒族，它是多形性颗粒，直径为50～60 nm，由两层磷脂组成的外膜包裹着RNA和蛋白质复合体，外膜上有两种糖蛋白，一种是HANA蛋白质，一种是F蛋白质，前者具有神经氨酸酶和血凝活性（分子量较大），后者具有融合和溶血作用（分子量较小）。 诱导细胞融合的机理：病毒被膜上的两种糖蛋白可和细胞膜表面的糖蛋白发生相互作用，从而使两个细胞可以互相接触，在电镜下观察到在相接触的相邻细胞表面之间将产生一些微小的细胞质桥。随着时间的推移，细胞质桥数量和桥的体积也在增加，最后相邻细胞的细胞质就结合在一起了，形成细胞凝集块再通过膜上蛋白质分子的重新排列，使膜中脂类分子重排而打开质膜，最后导致细胞融合。 形态学鉴定 形态标记即植物的外部特征，如花的形状及颜色、果实(种子)的形状及颜色、叶型、表皮毛、株型、穗型、千粒重、耐逆性以及对疾病的抗性等。形态标记简单直观，但是标记少、多态性差、易受环境条件和其它修饰基因的影响，并且许多性状为数量性状，由几个位点控制，表现为一个范围，而不是简单的性状差异。 杂种植物的核型分析 细胞标记主要包括染色体核型(染色体数目、大小、随体、着丝点位置等)和带型(C带、N带、G带等)。细胞学标记位点较少，而且对于亲缘关系较近的物种，由于细胞学标记差别不明显，所以很难根据细胞学特征来区分。 同工酶标记 同工酶为共显性，父本和母本的基因可以同时在后代中表达，不受环境因素影响，中仅有相对稳定;分析操作简便，所需材料较少;不足之处是位点数较少，植物10~20种同工酶表现出位点的多态性，覆盖的基因组范围有限。 染色体原位杂交 分子生物学标记 植物的分子标记主要有RAPD、RELP、AFLP、SSR、ISSR等。 （三） 杂种植株的再生和鉴定 植物原生质体融合及再生植株过程 杂种植株的鉴定方法： （1）杂种植物形态特征、特性鉴定 （2）杂种植物的核型分析 （3）同工酶分析 （4) 分子标记鉴定：RFLP、AFLP、SSR、ISSR 、RAPD标记鉴定 18条染色体 36条染色体 染色体原位杂交（Genomic in situ hybridization，GISH）是一项利用标记的DNA探针与染色体上的DNA杂交，在染色体上直接进行检测的分子标记技术。通常用同位素或生物素、地高辛标记的DNA探针与染色体DNA杂交，通过放射自显影或通过抗原抗体反应，在荧光显微镜下观察DNA探针与其互补的DNA序列结合的位置。最大优点是可以显示在体细胞杂种中哪条染色体来源于这个亲本，哪条染色体来源于另一个亲本，因而更准确、直观。 * 一、原生质体分离 二、原生质体分离及纯化操作 三、原生质体培养 四、体细胞杂交（原生质体融合） 五、原生质体的遗传饰变 第三节、植物原生质体技术及应用 体细胞杂交研究历程及一般概念 体细胞杂交的一般流程 杂交细胞的鉴定 1 2 3 细胞杂交的应用 4 （一）体细胞杂交的