Gene_6000_荧光定量PCR仪介绍.ppt

仪器概述 Rotor-Gene 6000的升降温示意图。 Rotor-Gene 6000光学系统示意图。 常用配件 准备一个反应 准备一个反应 准备一个反应 设置一个运行 设置一个运行 设置一个运行 设置一个运行 设置一个运行 设置一个运行 设置一个运行 设置一个运行 设置一个运行 设置一个运行 设置一个运行 设置一个运行 设置一个运行 Comparative Delta-delta Ct 定量流程简介 先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个基因的扩增效率是否一致或接近，将扩增效率优化为一致； 同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中 Comparative Delta-delta Ct 定量流程简介 反应最初，虽然产物是指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。当累积了足够的扩增产物，可以产生可检测的荧光信号时，这个循环数叫初始循环数，即Ct。 由于Ct值处于指数期内，这时的反应成分不会抑制扩增反应进行，因此荧光定量PCR结果是可靠的，可以准确的反映反应体系中模板的初始量。 假定的例子介绍使用Delta-delta Ct 法来决定一个目标基因（p53）在肿瘤和正常卵巢组织的表达的相对水平。 Comparative Delta-delta Ct 定量流程简介 例子：正常和肿瘤组织50ngRNA得到的cDNA用来分析p53（目标基因）和 GAPDH（参照基因）。 研究表明GAPDH在正常和肿瘤组织中没有差异。 样品 Ct p53（目标基因） Ct GAPDH（参照基因） 正常（校准样本） 15.0 16.5 肿瘤（试验样本） 12.0 15.9 进行相对定量分析之前，在检测和校准的样品中靶基因的Ct值和内参的Ct 值进行归一化： △ Ct（正常）=15.0-16.5=-1.5 △ Ct（肿瘤）=12.0-15.9=-3.9 然后，试验样本与校准样本的△ Ct值进行归一化 △ △ Ct =△ Ct（肿瘤）- △ Ct（正常）=-3.9-(-1.5)=-2.4 最后，计算表达比率： 2 -△ △ Ct =2-（-2.4）=5.3 因此，肿瘤组织细胞的p53表达水平比正常细胞高5.3倍。 Comparative Delta-delta Ct 定量流程简介 Comparative Delta-delta Ct 定量流程简介 Comparative Delta-delta Ct 定量流程简介 Comparative Delta-delta Ct 定量流程简介 Comparative Delta-delta Ct 定量流程简介 Comparative Delta-delta Ct 定量流程简介 Comparative Delta-delta Ct 定量流程简介 双 标 准 曲 线 法 定 量 流 程 双 标 准 曲 线 法 定 量 流 程 双 标 准 曲 线 法 定 量 流 程 双 标 准 曲 线 法 定 量 流 程 双 标 准 曲 线 法 定 量 流 程 双 标 准 曲 线 法 定 量 流 程 双 标 准 曲 线 法 定 量 流 程 用SYRB Green进行体系的优化与验证 特 异 性 利 用 温 度 梯 度 优 化 体 系 利 用 温 度 梯 度 优 化 体 系 利 用 温 度 梯 度 优 化 体 系 利 用 温 度 梯 度 优 化 体 系 利 用 温 度 梯 度 优 化 体 系 利用温度梯度优化退火温度-简易法（节约试剂） 最 佳 退 火 温 度 的 选 择 最 佳 退 火 温 度 的 选 择 最 佳 退 火 温 度 的 选 择 最 佳 退 火 温 度 的 选 择 最 佳 退 火 温 度 的 选 择 最 佳 退 火 温 度 的 选 择 最 佳 退 火 温 度 的 选 择 最 佳 退 火 温 度 的 选 择 最 佳 退 火 温 度 的 选 择 最 佳 退 火 温 度 的 选 择 用 标 准 曲 线 验 证 如何进行梯度稀释 使用标准曲线检查扩增效率 连续进行10倍稀释 R2值检测实验的重复性和线性 谢谢！ Rotor-Gene 6000采用创新性的转子式设计的定量遗传扩增检测系统，用于检测、定量和或对样品的基因型进行分析。 Rotor-Gene 6000具有前瞻性的转子式设计，保证了任何分子实验中最严苛的条件因子，即样品间的最佳的温度均一，从而能够提供高质量的数据。 样品以400rpm持续离心。离会不会造成探针或染料