宏基因组技术在微生物中的应用 (2).ppt

宏基因组技术在微生物中的应用 蒋超 4031031182 1.宏基因组概述 2.环境宏基因组学基本技术 3.环境宏基因组学技术的主要瓶颈 1.宏基因组概述1.1.微生物资源开发应用的新途径 据估计每克土壤样品中可含有高达4,000种的不同微生物，1g土壤就包含6. 1×107个基因。 传统途径—培养途径 开发环境微生物基因资源较为传统的研究途径是:分离微生物,获得纯培养,基因表达产物活性检测、活性物质的分离纯化直至开发利用。这一途径被证明是十分有效的,也获得了诸多有应用价值的活性物质。但是,环境中仅有0. 1% ~1%的微生物能够采用现有培养技术进行分离培养,在今天采用传统培养方法已很难发现新的活性物质,极大地限制了未培养微生物基因资源的开发利用。 新途径—宏基因组途径 近年来发展起来的宏基因组克隆技术,直接提取环境样品核酸进行遗传操作,避开了微生物分离培养问题,极大地扩展了微生物资源的利用空间。已在土壤生态环境、海洋生态环境和各种极端环境中开展应用。 1.2.宏基因组定义 “1998年Handelsman等首次提出宏基因组的概念。一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系、及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。 宏基因组文库既包括了可培养的,又包括了未培养的微生物遗传信息,因此增加了获得新生物活性物质的机会。 采用构建宏基因组文库的策略筛选新的基因资源及其表达活性产物的一般流程可以归纳为:样品和基因(组)的富集;提取特定环境中的基因组DNA或mRNA;构建宏基因组DNA或cDNA文库;筛选目的基因;目的基因活性产物表达。 2.环境宏基因组学基本技术 环境宏基因组学研究的基本思路是直接提取环境中所有微生物的基因组DNA,克隆到合适的载体,通过构建宏基因组文库,将环境中全部微生物的核酸信息收集在一起,运用序列筛选或功能筛选方式从文库中获得有用的酶、抗生素等生物活性物质及相关基因。 其前端关键性技术是环境DNA(environmental DNA,eDNA)的提取,eDNA提取方法的精确程度将直接决定文库中微生物信息的精确度;下游关键性技术是文库的分析与筛选技术。 2.1环境样品及目的基因组富集 在宏基因组文库筛选过程中目的基因仅占总DNA的一小部分,对环境样品的预富集可以大大提高目的基因的检出几率。目前预富集技术主要分为细胞水平富集和基因组水平富集。 细胞水平富集主要是通过利用选择培养基对目的微生物进行富集培养,最常用的方法是底物选择,此外还包括营养选择及物理化学指标选择。但是由于富集培养选择性地富集了具有快速生长特性的菌群,因此导致大部分物种多样性信息丢失。目前可以通过先在严格胁迫条件下短期处理,然后改为较温和的处理条件,可以从一定程度上克服这种方法的局限性。 基因组水平富集常用的技术为稳定同位素探针技术(SIP),原理是采用稳定同位素标记底物,其中的“重”原子掺入到具有代谢活性的微生物核酸中,采用密度梯度离心的方法将“重”的DNA与“轻”组分分离,被标记的“重”核酸可以作为PCR的模板,用来构建宏基因组文库。此外,还有报道利用抑制性消减杂交技术、差异显示技术、噬菌体展示技术、亲和捕获技术及DNA微阵技术等技术来富集目的基因。 2.2.环境宏基因组文库筛选技术 环境宏基因组文库的筛选策略主要分为序列筛选和功能筛选2种。序列筛选策略是先从文库中获得目的基因,继而对之异源表达,得到具有生物活性的产物;功能筛选策略则是先获得具有生物活性的阳性克隆子,再通过插入片段测序,得到相应的基因结构。2种分析策略对于充分利用宏基因文库资源都是必要的。 2.3宏基因组DNA的提取 获得高浓度、大片段、无偏好的环境样品总DNA是宏基因组文库构建的难点之一。 近年已有多种宏基因组DNA的提取纯化方法陆续建立起来,大体可分为两类:一类是直接提取法,又称原位提取法。这类方法不经过样品中微生物的培养和分离,通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释放,并对DNA进行纯化。 该法操作简便、省时、成本低,所获得DNA具有较好的完整性,并能够代表某一生境的微生物群落多样性。但常会出现细胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题,所以一般需要进一步的DNA纯化处理,同时所提取获得的DNA片段较小(1kb~50kb),主要适用于小片段文库的构建。 另一类是间接提取法,即异位提取法,是利用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来,再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物细胞提取DNA。 该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较少,纯度较高