酵母双杂交 Yeast Two hybrids.ppt

基因功能的研究方法之三—— 蛋白质相互作用的研究 蛋白质与蛋白质之间的相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分；蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号传导有重要意义；蛋白互作是蛋白质组学的重要研究内容。 研究蛋白质相互作用的方法： 1）酵母双杂交 （The yeast two-hybrid system ） 2）免疫共沉淀技术 （Co-Immunoprecipitation，Co-IP） 3）GST pull-down技术 （GST pull-down ） 1）The yeast two-hybrid system What is the yeast two hybrid system？ The two-hybrid system is a sensitive in vivo assay for the detection of specific protein-protein interactions . 酵母双杂交系统的建立： 由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立 。 典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4等都含有两个分立的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用， 启动它所调节的基因的转录。 单独的DNA结合域或转录激活域均不能激活下游基因的转录，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 酵母双杂交系统的模型 酵母双杂交系统中两个“Hybrid”的构建 X与Y蛋白的相互作用，将BD与AD拉近到一定的空间距离 How can we know if our two proteins interact？？？ a reporter gene (e.g. gal4-lacZ - the beta-galactosidase gene) is transcriptionally activated. And you get a color reaction within yeasts cultured on specific media. You can use the system to:? Test for interactions between two proteins for which you have the genes.? Screen a protein from a expression library which interacts with a protein you have.? 从一个表达库中筛选与已知蛋白相互作用蛋白的示意图 The gene you have is called the bait. The gene you catch with the bait is the prey. This is achieved by making a cDNA library in a special vector so that the yeast translates the gene you have cloned as a cDNA as a fusion with the part of the Gal4 protein.? LacZ reporter - Blue/White Screening HIS3 reporter - Screen on His+ media (usually need to add 3AT to increase selectivity) LEU2 reporter - Screen on Leu+ media ADE2 reporter - Screen on Ade+ media URA3 reporter - Screen on Ura+ media (can do negative selection by adding FOA) 常用的报告基因 酵母双杂交的大致步骤： 1）视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合结构域融合，构建成诱饵质粒。 2）将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活结构域融合，构建成文库质粒。 3）将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 4）利用报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 优点： 1）in vivo 2）活细胞内真实互作 3）可检查瞬时作用 4）分析多种亚细胞定位的蛋白 缺点： 1）假阳性问题 2）融合蛋白必须能进入细胞核内3）外源蛋白的毒性作用 4）假阴性问题 反向酵母双杂交系统 确定了蛋白之间的