植物细胞培养技术.ppt

植物下细胞培养技术 植物细胞培养技术的概念 植物细胞培养：是指从植物体中获得 植物细胞，然后在一定的条件下培养，以获得所需的细胞或各种产物的技术过程。 植物细胞培养技术的理论基础 植物细胞的全能性：植物的每个细胞都包 含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。 细胞分化：细胞在生长发育的过程中，在形态、结构、生理功能等方面发生某些特异性差异的过程。 脱分化：在某些特定条件下，分化细胞的基因活动模式会发生可逆的变化，重新回到未分化状态，这个过程成为脱分化。 植物单细胞的获取 一、从外植体直接分离细胞 （一）、机械捣碎法 先将叶片等外植体轻轻捣碎，然后通过过滤和离心分离细胞。 优点： 1、获得的植物细胞没有经过酶 的作用，不会受伤害。 2、不需要经过质壁分离，有利于进行生理生化研究。 缺点： 由于受到机械作用，细胞结构会受到一定的伤害，获得完整的细胞团或细胞数量少。 （二）、酶解法 利用果胶酶、纤维素酶等处理，分离出具有代谢活性的细胞。该法不仅能降解中胶层，还能软化细胞壁。所以，用该法分离细胞时，对细胞给予渗透压保护，如添加适量甘露醇。 二、通过愈伤组织诱导获取植物细胞 （一）、概念 愈伤组织：植物各种器官的外植体在离体的条件下，细胞经过脱分化等一系列过程，重新转化为未分化细胞，继而形成一种能快速增殖的无特定结构和功能的薄壁细胞团，称为愈伤组织。 （二）、影响愈伤组织诱导的因素 1、要有合适的外植体。一般来说，外植体细胞分化程度越高，脱分化越困难，所需时间越长 2、要有适宜的培养基和培养条件。植物激素的种类和浓度最为重要。 3、光照和温度也影响愈伤组织的发生。 4、NH4+/NO3-的浓度比对愈伤组织的诱导也有影响。浓度比为4:1时，诱导率最高。 （三）、从愈伤组织分离得到植物细胞 诱导获得的愈伤组织可以用小刀或镊子分割得到植物小细胞团，也可以将愈伤组织转移到液体培养基中，加入杀菌的玻璃珠，振荡培养，使愈伤组织分散成小细胞团或单细胞，然后过滤，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。 三、通过原生质体获取植物细胞 原生质体：出去细胞壁后得到的微球体。 （一）、原生质体的分离 1、机械法：使细胞发生质壁分离，然后切开细胞壁使原生质释放出来。 特点：排除了外加酶对原生质体结构和代谢的不利影响，但产生的原生质体少，对于细胞质浓密、液泡小的分生组织不适用。 2、酶解法：将果胶酶和纤维素酶混合处理材料。 特点：能在较短时间内获得大量原生质体，并能从分生组织获得原生质体，但是，酶可能对原生质体有毒害作用。 3、影响因素：材料的种类与生理状况、酶的种类与浓度、酶解时间、渗透压稳定剂和质膜稳定剂等。 （二）、原生质体的纯化 供体体材料经酶处理后，除有完整的原生质体外还有未被消化的细胞、破碎的原生质体，叶绿体、线粒体等，可以用镍丝网除去较大碎屑，进一步纯化方法有下三种： 1、沉降法：离心，使原生质体下沉，碎片留于上清液。 2、漂浮法：根据密度不同，利用密度大的高渗溶液，离心后使原生质体漂浮其上，碎片等沉底。 3、界面法：采用两种不同密度的溶液，离心后使完整的原生质体处于两液相的界面。 （三）、原生质体再生形成植物细胞 原生质体分离后，经过技术和适当稀释，在一定条件下进行原生质体培养，使细胞壁再生，从而得到植物单细胞，单细胞培养，长成细胞团，再经过继代培养，形成由原生质体形成的细胞系。采用固体培养或者液体静止培养，形成植物细胞。 植物单细胞的培养方法 （一）、看护培养法 1、概念； 采用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单细胞，使单细胞持续分裂和增殖，而获得单细胞形成的细胞系的方法。 2、基本过程： （1）、配制好宜于愈伤组织继代培养的固体培养基。 （2）、将生长活跃的愈伤组织块植入固体培养基中间部位。 （3）、愈伤组织上方放置一片面积为1平方厘米的滤纸，滤纸下方紧贴培养基和愈伤组织块。 （4）、取一小滴经过稀释的单细胞悬浮液接种于滤纸上方。 （5）、置于培养箱，在一定的温度和光照条件下培养若干天，单细胞在滤纸上进行持续分裂和增殖，形成细胞团