植物育种学-植物原生质体培养与体细胞杂交.ppt

植物育种学 第12章----生物技术在植物育种中的应用 第二节---植物原生质体培养与体细胞杂交 制作人：2010级种子二班 宋子超 2012.11.11 植物原生质体培养与体细胞杂交 植物原生质体培养是指将植物细胞去壁后，在无菌条件下，使其进一步生长发育的技术。 体细胞杂交是在离体条件下将同一物种或不同物种的原生质体融合，培养并获得杂种细胞的再生植株。 自1971年烟草叶片分离原生质体并培养获得再生植株以来，已有280余种植物原生质体再生植株问世。 原生质体融合克服了植物种属间生殖障碍，为新种质的创造提供了一条有效途径 过程： 1、原生质体的分离与培养 2、原生质体融合 3、杂种细胞的选择 4、杂种细胞的鉴定 一、原生质体的分离与培养 （一）原生质体的分离 1、制备原生质的材料： 分为 ①、自然条件下生长的植株：可以从植株各个组织器官分离原生质体，常用的是叶肉细胞（来源方便、供应及时、有明显的叶绿体便于在融合中识别） ②、无菌幼苗：无菌幼苗的子叶、下胚轴和根均可分离。优点：无需经表面灭菌处理，避免杀菌剂对材料的伤害，且实验结果容易重复。缺点：培养室光照不够，苗弱制备原生质体的产量比较低，质膜较易破。 ③、外植体来源的愈伤组织、体细胞胚及悬浮培养细胞： 优点： 这种材料可避免环境条件的不良影响，可常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便。缺点：染色体不稳定，长期培养的细胞培养物是整倍体与非整倍体的混合物，使植株再生率降低。 2、材料的预处理 目的是为了提高原生质体的 产量和代谢活力；逐步降低植物细胞水势，增强原生质体对培养及高渗透压的适应；使游离的原生质体更能适应新的培养条件。 处理方法： ①：预培养法：材料先在一定配方培养基上培养然后再分离原生质体 ②：暗处理法：材料暗处培养一定时间再分离原生质体 ③：药物及添加剂处理法：材料在添加剂或药物处理后，再进行原生质体的分离 ④：萎蔫处理法：离体叶片置日光或灯光下照射2~3小时，叶片稍萎调，易于撕去下表皮，有利于酶降解叶肉细胞壁 ⑤：更新培养基法 3、原生质体的分离 植物原生质体分离有机械分离和酶分离法，目前一般采用酶法分离，酶法分离是指在酶的作用下分解细胞壁获得原生质体，优点是快速大量。 酶法分离注意事项： ①、酶的种类和用量：根据植物材料不同以及细胞壁成分不同确定。纤维 素酶、半纤维素酶、果胶酶。 ②、酶液的渗透势：细胞内外的渗透压必须平衡否则原生质体易破裂。 ③、酶液的酸碱度：酶液的PH对原生质体的产量和活力有很大的影响。不同植物材料对酶液的PH要求有别。 ④、温度环境：分离时间与温度和不同的材料酶活力植物细胞特点有关。 ⑤、通气条件对原生质体的量和质也有明显的影响：通气良好原生质体量多健康，否则产量低健康的少。 4、原生质体的纯化 酶分解后的植物组织是由未消化的细胞和细胞团、破碎细胞及原生质体等组成的混合物，需提纯。 方法有： ①：过滤-离心法：简单易收集大量原生质体，常用。 ②：漂浮法：根据原生质体、细胞或细胞碎片的相对密度不同而设计的。 5、原生质体的活力测定 原生质体的活力测定，原生质体的活力测定决定以后的培养成功。 形态识别：完整饱满的细胞质、颜色鲜艳、正常膨大。→有活力！ （二）、原生质体培养 1、培养基及培养条件：不同植物的原生质体对营养需求不同。KM培养基、V-KM培养基 除培养基外还注意： （1）、植物激素：生长调节剂的种类和浓度，2,4-D。 （2）、原生质体的密度 （3）、光照和温度 （4）、氮源种类 2、原生质体培养方法：固体培养法和液体培养法 3、原生质体培养过程 培养条件满足的条件下，原生质体首先会形成新的细胞壁，继而进行分裂，形成细胞团。在促进分化的条件下还能分化出芽、茎、根，再生成完整植株。 （1）、细胞壁再生 ： 再生壁开始的时间随所用的植物材料种类及取材来源而异。 （2）、细胞分裂：第一次细胞分裂依赖于壁的形成。 （3）、植株再生 ： 原生质体形成小的细胞团或愈伤组织，转移到固体分化培养基上后就开始形态发生而逐渐长成完整的植株。